MERS-CoV动物感染模型研究：狨猴与小hDPP4-BALB/c小鼠模型的建立与比较
摘要：
中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）的高致病性迫切需要有效的动物模型以研究其发病机制、传播途径及评估干预措施。本研究成功建立了两种关键模型：通过经气管途径感染狨猴的重症模型，以及利用滴鼻途径感染表达人DPP4（hDPP4）受体的转基因BALB/c小鼠模型。两种模型分别模拟了人类感染的关键特征，为深入研究MERS-CoV提供了重要工具。
一、 引言
MERS-CoV是一种由动物传染至人类的新型冠状病毒，可引发严重呼吸道疾病甚至死亡。由于普通实验动物对MERS-CoV不易感或仅表现轻微症状，建立可靠且能模拟人类疾病特征的动物模型是研究的核心挑战。人二肽基肽酶4（hDPP4）是MERS-CoV的功能性受体，其在动物体内表达模式及分布是决定易感性的关键因素。
二、 材料与方法
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病毒与细胞：
- 使用临床分离鉴定的MERS-CoV毒株（例如：EMC/2012株）。病毒在允许细胞系（如Vero E6细胞）中增殖。
- 病毒滴度通过组织培养半数感染量（TCID₅₀）或噬斑形成单位（PFU）测定。
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动物模型建立：
- 模型一：经气管接种感染的狨猴模型
- 动物： 健康成年普通狨猴。
- 感染前处理： 动物经适当麻醉。
- 感染途径与剂量： 通过气管内插管技术直接将一定量（如 1 × 10⁶ TCID₅₀）的MERS-CoV病毒液缓慢滴注入气管下部/肺部。
- 对照： 设立接种无菌PBS或培养基的对照组。
- 模型二：滴鼻接种感染的hDPP4-BALB/c小鼠模型
- 动物： 通过转基因技术使BALB/c小鼠在其主要细胞类型（尤其是呼吸道上皮细胞）上稳定表达人源DPP4（hDPP4）受体。
- 感染途径与剂量： 轻度麻醉小鼠，将一定量（如 1 × 10⁵ TCID₅₀）的MERS-CoV病毒液缓慢滴注于小鼠鼻腔（每侧鼻孔各半）。
- 对照： 设立同窝非转基因野生型BALB/c小鼠或接种无菌PBS的转基因小鼠作为对照组。
- 模型一：经气管接种感染的狨猴模型
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监测与样本采集：
- 临床观察： 每日多次观察记录动物的精神状态、活动度、呼吸状况（频率、深度）、体重变化等。
- 体温监测： 定期测量体温。
- 样本采集： 在感染后不同时间点（如第1, 3, 5, 7天及恢复期/终点），采集鼻咽拭子、气管灌洗液、血液以及不同组织器官（肺、肾、脾、脑等）样本。
- 病理学检查： 动物安乐死后，进行大体病理观察，采集组织样本进行福尔马林固定、石蜡包埋、切片及苏木精-伊红（H&E）染色观察组织病理变化。
- 病毒学检测：
- 病毒载量检测： 使用定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组织、拭子、灌洗液中的病毒RNA载量。
- 病毒分离滴定： 尝试从样本中分离活病毒并进行滴度测定。
- 免疫学检测： ELISA等方法检测血清中特异性抗体的产生；流式细胞术或免疫组化检测免疫细胞浸润和炎症因子表达。
三、 结果
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狨猴模型（经气管感染）：
- 临床症状： 感染后2-3天开始出现精神沉郁、活动减少、弓背、呼吸急促或困难等明显的呼吸道症状。部分动物出现发热、体重显著下降。严重病例可快速进展至死亡。
- 病毒： 在肺部检测到极高的病毒RNA载量和感染性病毒滴度，表明病毒在肺组织高效。病毒也可扩散至肺外器官，如肾脏、脾脏，甚至脑组织，但载量通常低于肺部。
- 病理变化：
- 大体： 肺脏可见弥漫性实变、出血、水肿；有时胸腔积液。
- 镜下： 弥漫性肺泡损伤（DAD），表现为肺泡间隔显著增厚（水肿、炎症细胞浸润、成纤维细胞增生）、透明膜形成、肺泡腔内出血、肺水肿。支气管上皮损伤、坏死、脱落。肾脏可见肾小管损伤。
- 免疫反应： 急性期可检测到强烈的炎症细胞（巨噬细胞、中性粒细胞）浸润和促炎因子风暴。后期检测到特异性中和抗体产生。
- 模型特点： 成功模拟了人类MERS的重症肺炎和系统性感染特征，死亡率较高（剂量依赖），是研究重症发病机制、肺损伤及评估重症治疗干预（如抗体、抗病毒药）的理想模型。
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hDPP4-BALB/c小鼠模型（滴鼻感染）：
- 临床症状： 转基因小鼠感染后出现明显的疾病体征：体重急剧下降（感染后3-5天达低谷）、竖毛、弓背、活动迟缓、呼吸频率加快。疾病严重程度与病毒剂量相关。非转基因对照小鼠无症状且无病毒。
- 病毒： 病毒主要在呼吸道高效。感染早期（1-3天）在鼻甲、气管、肺组织中检测到高水平的病毒RNA和感染性病毒。后期（5-7天）病毒载量逐渐下降。很少或几乎没有扩散至脑组织。
- 病理变化：
- 大体： 肺脏充血、点状出血。
- 镜下： 以支气管周围和血管周围炎症细胞（淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞）浸润为主要特征。肺泡腔内有炎性渗出，可见肺泡间隔增厚、局部肺不张。支气管上皮细胞损伤、脱落。病变程度通常轻于狨猴模型的重症肺炎。
- 免疫反应： 肺部炎症浸润明显，伴有促炎因子（如IL-6, TNF-α）水平升高。感染恢复期检测到针对MERS-CoV的特异性抗体反应。
- 模型特点： 成功模拟了MERS-CoV感染导致的呼吸道疾病和全身性病症。利用常见的BALB/c背景，具有成本相对较低、繁殖周期短、遗传背景清晰、免疫学工具丰富等优势，特别适用于高通量药物筛选、疫苗免疫原性及免疫保护效果评价、基础免疫应答机制研究等。
四、 讨论
本研究成功建立了两种互补的MERS-CoV动物模型：
- 狨猴模型（经气管感染）： 该模型克服了普通猴子不易感或症状轻微的局限。经气管接种直接将病毒送达下呼吸道，更直接地模拟了人类吸入感染或病毒向下呼吸道扩散的过程，导致严重的肺部病变和显著的临床疾病，高度模拟了人类重症MERS。该模型是评估重症治疗方案、抗病毒药物疗效和病理机制研究的金标准模型，但其成本高、伦理限制多、样本量小。
- hDPP4-BALB/c小鼠模型（滴鼻感染）： 通过转基因技术表达人受体hDPP4，解决了小鼠天然不易感的问题。滴鼻感染模拟了常见的经上呼吸道感染途径。该模型表现出明显的体重下降、呼吸道病毒高效及特征性肺部炎症病理，再现了人类感染的多个关键特征。其最大优势在于易于操作、成本可控、遗传背景均一、免疫试剂完备、允许大样本量研究，使其成为药物初筛、疫苗评价、免疫学研究的主力模型。
五、 结论
经气管感染建立的狨猴模型和滴鼻感染建立的hDPP4-BALB/c转基因小鼠模型，分别提供了用于研究MERS-CoV重症发病机制与治疗（狨猴模型）以及大规模疫苗免疫、药物筛选及宿主免疫反应（小鼠模型）的强大工具。这两种模型各有侧重、优势互补，共同构成了支撑MERS-CoV基础研究和干预措施开发的坚实平台，为最终战胜该疾病提供了关键的科学支撑。
