SARS-CoV-2 WH-09气管途径感染恒河猴模型

SARS-CoV-2 WH-09 株气管途径感染恒河猴模型的建立与评估

摘要：
本研究旨在建立并评估通过气管内接种途径感染恒河猴（Macaca mulatta）的 SARS-CoV-2 WH-09 株动物模型。该模型模拟病毒经呼吸道自然感染的途径，重点观察感染后的病毒动态、组织嗜性、病理变化及免疫反应。结果表明，气管途径感染可成功诱导恒河猴产生病毒、呼吸道症状及特征性肺部病理变化，为研究 SARS-CoV-2 致病机制、传播特性和干预措施评价提供了重要工具。

引言：
恒河猴因其生理结构、免疫系统与人类高度相似，成为研究人类呼吸道病毒感染的重要动物模型。SARS-CoV-2 主要通过呼吸道传播，建立模拟自然感染途径（如气管内接种）的动物模型，对于深入理解病毒-宿主相互作用、评估疫苗与药物效果至关重要。本研究采用临床分离株 WH-09，通过气管内滴注方式感染恒河猴，系统监测感染进程。

材料与方法：

1. 病毒株： SARS-CoV-2 WH-09 株（GISAID 登录号：EPI_ISL_XXXXXXX），于 Vero E6 细胞中扩增，测定感染性滴度（TCID50/mL 或 PFU/mL）。
2. 实验动物： 健康成年恒河猴（n=6），经检疫确认无特定病原体感染，SARS-CoV-2 血清抗体阴性。动物随机分为感染组（n=4）和对照组（n=2）。
3. 感染途径与剂量： 感染组动物经麻醉后，通过喉镜引导，使用无菌导管经气管插管，滴注含 1×10^6 TCID50 (或等效 PFU) SARS-CoV-2 WH-09 株的病毒悬液（体积 2-3 mL）。对照组滴注等体积无菌细胞培养液或 PBS。
4. 临床观察： 每日监测动物体温、体重、呼吸频率、精神状态、食欲及临床症状（如咳嗽、呼吸急促）。
5. 样本采集：
   • 鼻咽拭子/咽拭子： 感染后第 0、1、2、3、5、7、10、14 天采集。
   • 肛拭子： 感染后第 0、3、5、7、10、14 天采集。
   • 血液： 感染前及感染后第 3、7、14、21、28 天采集，用于血清分离（抗体检测）和 PBMC 分离（免疫分析）。
   • 病理学检查： 感染组于感染后第 3 天（n=2）和第 7 天（n=2）实施安乐死并解剖；对照组同期解剖。采集肺、气管、支气管、纵隔淋巴结、心、肝、脾、肾、肠等组织，部分用于病毒载量检测，部分固定于 10% 中性福尔马林用于组织病理学（H&E 染色）和免疫组化（IHC，检测病毒抗原如 N 蛋白）。
6. 检测方法：
   • 病毒载量： 使用 RT-qPCR 检测拭子和组织匀浆液中的病毒基因组 RNA（以拷贝数/mL 或拷贝数/g 组织表示）。部分样本进行病毒分离培养（Vero E6 细胞）确认活病毒存在。
   • 血清学检测： 采用 ELISA 和/或中和试验检测血清中抗 SARS-CoV-2 Spike 蛋白抗体及中和抗体滴度。
   • 组织病理学与免疫组化： 由病理学家对 H&E 染色切片进行盲法评估。IHC 评估病毒抗原在组织中的分布。

结果：

1. 临床症状： 感染组恒河猴在感染后 1-2 天出现短暂体温升高（约 1-1.5°C），部分动物表现出轻度食欲减退和精神稍萎靡。感染后 2-4 天，大部分感染动物出现轻度咳嗽和/或呼吸频率轻度增加。所有症状在感染后 5-7 天内逐渐缓解。对照组无异常表现。

2. 病毒与排出：

   • 上呼吸道： 鼻咽/咽拭子病毒 RNA 载量在感染后第 1 天即可检出，第 3-5 天达到峰值，之后逐渐下降，通常于第 10-14 天转阴或低于检测限。活病毒分离在感染早期（第 1-5 天）阳性。
   • 下呼吸道： 肺组织是病毒的主要部位。感染后第 3 天，肺组织中病毒 RNA 载量最高，并伴随明显的活病毒分离阳性。病毒载量在第 7 天显著下降。气管和支气管组织也检测到较高载量的病毒 RNA 和抗原。
   • 其他部位： 部分动物肛拭子在感染后 3-7 天可检测到低水平的病毒 RNA，但通常无活病毒。除呼吸道和淋巴结外，其他所检脏器（心、肝、脾、肾、肠）中病毒 RNA 载量极低或阴性。
    

   *表示病毒载量显著高于对照组 (p<0.05)；ND：未检测到。