大动物猴/犬肌肉活检

大动物（猴/犬）肌肉活检：检测项目详解

肌肉活检是诊断大动物（如猴、犬）神经肌肉疾病的核心手段。通过对特定肌肉的微小样本进行多维度分析，它能揭示肌肉结构、代谢、分子水平的异常，为精准诊断和治疗提供关键依据。以下重点介绍肌肉活检的核心检测项目：

一、 组织病理学检查 (Histopathology)

• 苏木精-伊红染色 (Hematoxylin and Eosin Staining, H&E):
  • 目的： 最基础的评估，提供肌肉整体结构的全景视图。
  • 观察重点：
    • 肌纤维形态： 大小是否均匀？是否存在异常萎缩（变小）或肥大（变大）？有无变性（如颗粒变性、玻璃样变性）、坏死、再生（带有中央核的肌纤维）？
    • 肌纤维分型： I型（慢缩氧化型）和II型（快缩型）纤维的比例和分布是否正常？有无群组化现象（提示神经源性损伤）？
    • 细胞浸润： 肌纤维间、肌束膜周围或血管周围有无炎性细胞（淋巴细胞、巨噬细胞等）浸润？程度如何？
    • 结缔组织： 肌内膜、肌束膜、肌外膜的结缔组织是否增生（纤维化）？
    • 肌核： 核的位置（是否居中？正常应位于周边）、大小、形态、数量是否异常？有无核内包涵体？
    • 血管： 血管结构是否正常？有无血管炎或血栓？
• 特殊组织化学染色：
  • 改良Gomori三色染色 (Modified Gomori Trichrome): 特别有助于显示：
    • 线粒体异常： 破碎红纤维 (RRF)，提示线粒体肌病。
    • 边缘空泡： 某些肌病（如包涵体肌炎）的特征。
    • 杆状体： 杆状体肌病的标志。
    • 结缔组织增生。
  • 糖原染色 (Periodic Acid-Schiff, PAS): 检测肌纤维内糖原含量是否异常增多（如糖原累积症）或减少。
  • 脂肪染色 (Oil Red O 或 Sudan Black): 检测肌纤维内或间质中脂滴是否异常堆积（如脂质沉积性肌病）。
  • 淀粉样蛋白染色 (如刚果红): 检测肌肉组织内是否有淀粉样物质沉积（如某些系统性淀粉样变性累及肌肉）。

二、 酶组织化学 (Enzyme Histochemistry)

• 目的： 直接在组织切片上定位和评估特定酶（主要是代谢酶）的活性，直观显示肌纤维代谢分型及酶活性缺陷。
• 常用检测：
  • 还原型辅酶I四氮唑还原酶 (NADH-TR):
    • 清晰显示肌纤维内部结构（肌原纤维网、线粒体分布）。
    • 有助于识别线粒体异常、中央轴空、靶纤维等。
    • 区分I型（深染）和II型（浅染）纤维。
  • 琥珀酸脱氢酶 (SDH): 特异性显示线粒体活性（线粒体呼吸链复合体II）。用于检测线粒体肌病（如RRF在SDH染色上也呈深染）。
  • 细胞色素C氧化酶 (COX): 显示线粒体呼吸链复合体IV的活性。在线粒体肌病中，可见COX缺失纤维（染色阴性）或COX/SDH双染显示的COX缺失纤维（SDH阳性而COX阴性）。
  • 腺苷三磷酸酶染色 (ATPase):
    • 主要作用： 最精确地区分I型和II型肌纤维（以及II型的亚型如IIa, IIx/d）。
    • 不同pH值预孵育：
      • pH 9.4: I型纤维淡染，II型纤维深染。
      • pH 4.6: I型纤维深染，II型纤维淡染。
      • pH 4.3: 区分IIa和IIx/d纤维。
    • 价值： 评估纤维类型比例、分布、群组化（神经源性损伤）或同型群组化（肌源性损伤）。
  • 酸性磷酸酶 (ACP): 标记溶酶体活性，在坏死肌纤维、再生纤维和某些炎性肌病中活性增高。
  • 碱性磷酸酶 (ALP): 在再生肌纤维的肌膜上表达增高。

三、 生化检测 (Biochemical Assays)

• 目的： 定量分析肌肉组织中特定物质的含量或酶的活性。
• 常用检测：
  • 肌酶活性测定： 定量测定肌肉匀浆中关键酶的活性，是诊断代谢性肌病的金标准之一。
    • 糖原代谢酶： 如肌磷酸化酶、磷酸果糖激酶、磷酸甘油酸激酶等（诊断糖原累积症）。
    • 脂质代谢酶： 如肉碱棕榈酰转移酶、多种酰基辅酶A脱氢酶等（诊断脂质沉积性肌病）。
    • 线粒体呼吸链酶复合体： 复合体I-V的活性测定（诊断线粒体肌病）。
  • 底物分析： 定量测定肌肉中：
    • 糖原含量： 诊断糖原累积症。
    • 肉碱水平： 总肉碱、游离肉碱和酰基肉碱谱（诊断原发性或继发性肉碱缺乏症）。
    • 辅酶Q10水平： 诊断辅酶Q10缺乏症。
    • 有机酸/酰基肉碱谱： 通过质谱分析筛查多种代谢缺陷。

四、 免疫组织化学/免疫荧光 (Immunohistochemistry/Immunofluorescence)

• 目的： 利用特异性抗体检测肌肉组织中特定蛋白的表达、定位、缺失或异常沉积。
• 常用检测：
  • 肌营养不良蛋白复合物相关蛋白：
    • Dystrophin (C端、N端、Rod区)：诊断杜氏/贝氏肌营养不良症。
    • Sarcoglycans (α, β, γ, δ)：诊断肢带型肌营养不良症。
    • Dysferlin：诊断肢带型肌营养不良症2B型/Miyoshi肌病。
    • Merosin (Laminin α2)：诊断先天性肌营养不良症。
  • 肌膜修复蛋白： Caveolin-3。
  • 肌原纤维蛋白： Desmin (诊断结蛋白病)， Myotilin。
  • 炎症标记物： MHC-I（在炎性肌病中常异常表达于肌膜）， CD4+, CD8+, CD20+, CD68+等免疫细胞标记（评估炎症类型和程度）。
  • 神经源性标记： 如神经丝蛋白、S-100等（辅助判断是否合并神经源性损伤）。
  • 异常沉积物： β-淀粉样蛋白、泛素、TDP-43等（诊断包涵体肌炎等）。

五、 分子检测 (Molecular Studies)

• 目的： 在DNA或RNA水平上检测与神经肌肉疾病相关的基因变异（突变、缺失、重复等）。
• 常用技术：
  • 聚合酶链式反应 (PCR)： 扩增特定基因片段。
  • Sanger测序： 对特定基因外显子进行测序，寻找点突变、小片段插入/缺失。
  • 多重连接探针扩增技术 (MLPA)： 检测基因大片段的缺失或重复（如DMD基因缺失/重复检测）。
  • 下一代测序 (NGS):
    • 基因包测序 (Gene Panel Sequencing): 同时检测一组已知相关基因。
    • 全外显子组测序 (WES): 检测所有编码蛋白的外显子区域。
    • 全基因组测序 (WGS): 检测整个基因组（包含非编码区）。
• 样本来源： 肌肉活检组织提取的DNA/RNA通常是理想样本（尤其适用于嵌合体或组织特异性表达异常的检测），也可用血液样本。

六、 电子显微镜检查 (Electron Microscopy)

• 目的： 在超微结构水平观察肌肉细胞器（如肌原纤维、线粒体、肌浆网、糖原颗粒、脂滴、溶酶体等）的细微异常。
• 价值： 对于常规光镜和组织化学无法确诊的病例至关重要，尤其擅长诊断：
  • 某些线粒体肌病（如线粒体形态、嵴的异常）。
  • 某些包涵体肌病（如发现特征性丝状包涵体）。
  • 杆状体肌病（发现杆状体）。
  • 管聚集（某些周期性麻痹或肌强直综合征）。
  • 糖原或脂质沉积的形态细节。
  • 细胞核内包涵体（如核内杆状体、包涵体）。

重要注意事项

• 样本质量至关重要：
  • 选择合适肌肉： 通常选择中度受累的肌肉（如股四头肌、肱二头肌），避免取用过早或终末期萎缩的肌肉或注射点附近。
  • 操作技巧： 轻柔操作，避免钳夹或过度牵拉造成人为损伤。获取样本后需立即进行适当处理。
• 预处理与保存：
  • 组织化学/光镜样本： 通常置于生理盐水湿润纱布上（避免干燥），尽快（最好在30分钟内）进行速冻（异戊烷液氮冷冻），保存在-80°C冰箱。部分样本可固定于福尔马林用于石蜡切片。
  • 电镜样本： 立即切成极小方块（1mm³），固定于专用电镜固定液（如戊二醛）。
  • 生化样本： 速冻后保存在-80°C冰箱待匀浆分析。
  • 分子样本： 新鲜组织保存于专用稳定液或速冻于-80°C冰箱。
• 结果解读需结合临床： 肌肉活检结果的解读必须紧密结合动物的详细病史、临床症状、神经学检查、血清肌酶谱（如CK、AST）、肌电图、影像学等结果。单凭活检结果可能无法做出最终诊断。
• 多技术整合应用： 现代肌肉病理学诊断依赖于多种技术的整合应用（光镜、酶组化、免疫组化、电镜、生化、分子）。根据初步发现，可能需要加做特定项目。

总结

大动物（猴/犬）肌肉活检是一项强大而复杂的诊断工具。通过系统性地应用组织病理学、酶组织化学、免疫组织化学、生化分析、分子检测和电子显微镜等多种技术，能够深入剖析肌肉病变的性质、定位和病因。精确的检测项目选择、规范的样本采集处理流程以及结合临床信息的综合分析，是确保活检结果准确可靠、最终为临床诊断和治疗决策提供关键支持的基础。