血浆蛋白结合率测定

血浆蛋白结合率测定：核心检测项目解析

血浆蛋白结合率（Plasma Protein Binding, PPB）是药物研发与临床用药中至关重要的药代动力学参数。它反映了药物在血浆中与蛋白质（主要是白蛋白和α1-酸性糖蛋白）结合的比例，直接影响药物的分布、代谢、排泄以及最终疗效与毒性。精准测定PPB对理解药物体内行为、预测药物相互作用及制定合理给药方案具有决定性意义。以下重点介绍该测定的核心检测项目与方法学。

一、 核心检测项目

血浆蛋白结合率测定本质上是对以下核心参数的量化：

1. 游离药物浓度 (Cf)： 指在特定实验条件下，未与血浆蛋白结合、具有生物活性的药物分子在血浆或缓冲液中的浓度。这是计算结合率的基础。
2. 总药物浓度 (Ct)： 指在血浆样本中测定的药物总浓度，包括与蛋白结合的部分和游离部分之和。
3. 结合药物浓度 (Cb)： 由总药物浓度减去游离药物浓度得到 (Cb = Ct - Cf)。
4. 血浆蛋白结合率 (PPB)： 最核心的检测结果。通常以结合药物占总药物的百分比表示：
   • PPB (%) = (Cb / Ct) × 100%
   • 或 PPB (%) = [(Ct - Cf) / Ct] × 100%
5. 游离分数 (fu)： PPB的互补参数，指游离药物占总药物的比例：
   • fu = Cf / Ct
   • PPB (%) = (1 - fu) × 100%
6. 结合常数 (Ka) 与结合位点数 (n)： 在深入研究药物-蛋白相互作用机制时，可通过在不同浓度下测定fu，利用Scatchard分析等方法计算药物与特定蛋白的结合常数和结合位点数。

二、 核心检测方法学

准确分离游离药物与结合药物是测定的关键步骤。主要方法包括：

1. 平衡透析法：

   • 原理： 利用半透膜（允许小分子游离药物通过，阻止大分子蛋白及其结合的药物通过）分隔两个腔室（血浆室与缓冲液室）。系统达到平衡后，缓冲液室中的药物浓度即为游离药物浓度 (Cf)，血浆室中的药物浓度为总浓度 (Ct)。
   • 关键步骤：
     • 装置准备：清洗、平衡半透膜（常用再生纤维素膜）。
     • 加样：血浆室加入含药血浆，缓冲液室加入等渗缓冲液（如磷酸盐缓冲液）。
     • 恒温振荡：在生理温度（通常37°C）下进行足够长时间的透析（通常数小时至过夜），达到平衡。
     • 取样与测定：分别取缓冲液室（Cf）和血浆室（Ct）样品，采用高灵敏度分析方法（如LC-MS/MS）测定药物浓度。
   • 优点： 原理清晰，被视为“金标准”，适用于大多数药物，尤其对高结合率药物准确度高。
   • 缺点： 耗时长，存在稀释效应（缓冲液稀释血浆导致结合平衡移动），存在膜吸附或药物不稳定风险，操作相对繁琐。

2. 超滤法：

   • 原理： 在离心力或压力作用下，迫使游离药物分子通过超滤膜（分子量截留值通常为10-30 kDa，能截留血浆蛋白），收集滤液（超滤液）中的药物浓度即为游离药物浓度 (Cf)。超滤前的血浆样品测定总浓度 (Ct)。
   • 关键步骤：
     • 样品准备：含药血浆在37°C孵育平衡。
     • 超滤：将血浆加入超滤离心管，在严格控制温度（通常37°C）和离心力/压力下进行超滤。
     • 收集滤液：收集足量超滤液用于分析。
     • 浓度测定：分别测定超滤液（Cf）和原始血浆/超滤后截留液适当稀释液（Ct）中的药物浓度。
   • 优点： 快速简便（通常<1小时），样品处理量相对较大，接近生理条件（无稀释），适用于高通量筛选。
   • 缺点： 可能存在膜吸附（尤其对亲脂性药物），离心可能导致局部升温影响结合平衡（需控温），高结合率药物在滤液中浓度极低，对分析方法灵敏度要求极高。

3. 超速离心法：

   • 原理： 在超高速离心力（>100,000 - 300,000 g）作用下，血浆蛋白沉降形成沉淀，上清液理论上仅含游离药物。测定上清液浓度即为Cf，原始血浆浓度即为Ct。
   • 关键步骤：
     • 高速离心：含药血浆在严格控制温度（4°C或37°C）下进行长时间超速离心。
     • 小心分离：吸取上清液，避免扰动沉淀。
     • 浓度测定：测定上清液（Cf）和原始血浆（Ct）药物浓度。
   • 优点： 无需半透膜或超滤膜，避免了膜吸附问题。
   • 缺点： 设备昂贵（超速离心机），离心过程长（数小时），操作需极其小心避免沉淀污染上清液，高密度脂蛋白等可能不完全沉降影响结果。

4. 其他方法：

   • 凝胶过滤色谱法： 利用分子大小差异分离游离药物与蛋白结合物。操作较复杂，较少用于常规测定。
   • 光谱法： 如荧光偏振、表面等离子体共振等，适用于特定具有光学活性或能标记的药物，可用于研究结合动力学。
   • 微透析： 在体或离体进行，更接近生理状态，但技术复杂，通量低。

三、 方法选择与关键考量因素

选择何种方法取决于药物特性、研究目的、资源与时间限制：

• 药物理化性质： 亲脂性（膜吸附风险）、稳定性（在实验条件下是否降解）、分子量。
• 预期结合率： 高结合率药物对Cf检测的灵敏度要求极高。
• 通量需求： 高通量筛选倾向于超滤法。
• 数据准确性要求： 关键研究或对结果有争议时，平衡透析法仍是首选。
• 实验条件控制： 严格控制温度（37°C）、pH（生理pH值，通常7.4）、避免稀释（超滤法优势）或校正稀释（平衡透析法）至关重要。
• 分析方法的灵敏度与特异性： 特别是Cf通常很低，需LC-MS/MS等高灵敏度方法。需验证方法不受基质干扰。

四、 结果报告与解读

测定报告应清晰呈现：

1. 使用的测定方法（及关键条件如温度、pH、缓冲液成分、膜类型/截留值）。
2. 测定的游离分数 (fu) 和/或血浆蛋白结合率 (PPB%)。
3. 使用的药物浓度（应在治疗相关浓度范围内，通常需测试多个浓度点以考察浓度依赖性）。
4. 实验重复次数和结果变异（如标准差或置信区间）。
5. （如适用）结合常数 (Ka) 和结合位点数 (n)。

解读时需注意：

• PPB值具有浓度依赖性（尤其当结合位点饱和时）。
• 不同种属的血浆蛋白组成不同，结果外推需谨慎（如动物实验数据用于人）。
• 疾病状态（如肝病、肾病、炎症）可能改变血浆蛋白水平和结合能力。
• 合并用药可能因竞争结合位点而改变PPB（药物相互作用）。

结论

血浆蛋白结合率测定是药物研发和临床药理学不可或缺的环节。精确测定游离药物浓度 (Cf) 和总药物浓度 (Ct) 是其核心，由此计算得到的游离分数 (fu) 或结合率 (PPB%) 是理解药物体内处置与活性的关键参数。平衡透析法、超滤法和超速离心法是主流技术，各有优劣，选择需科学权衡。严格控制实验条件、采用高灵敏度特异性分析方法、理解结果的局限性和影响因素，是获得可靠、有意义数据的基础，为药物安全性评价、有效剂量设定及合理用药提供坚实依据。