生殖/发育毒性筛选试验

生殖/发育毒性筛选试验：核心检测项目详解

生殖与发育毒性研究是评估化学物质（包括药物、农药、工业化学品等）对人类生殖健康潜在危害的关键环节。生殖/发育毒性筛选试验（Reproductive/Developmental Toxicity Screening Test）通常作为初步评估手段，旨在系统性地检测受试物对配子发生、交配行为、受孕、胚胎发育、分娩及子代生长发育等多方面的影响。其核心在于一系列精心设计的检测项目。

一、 试验设计要点

• 动物模型： 通常选用健康、性成熟的啮齿类动物（大鼠或小鼠），因其生殖周期短、经济实用且与人类生殖系统具有一定可比性。
• 剂量分组： 至少设三个剂量组（高、中、低）和一个溶剂/赋形剂对照组（阴性对照）。高剂量应能诱导明显的毒性效应（但不成批死亡），低剂量应接近预期的人体暴露水平（NOAEL）。
• 给药途径与时间： 模拟人体暴露途径（如经口、吸入、皮肤）。给药期覆盖完整的生殖周期：雄性通常在交配前持续给药一定时间（覆盖精子发生周期），雌性则从交配前开始，持续整个交配期、妊娠期直至哺乳结束。
• 交配： 通常采用1:1（雄:雌）同笼交配。记录交配行为及成功交配证据（如阴栓或阴道涂片精子检查）。
• 观察期： 从给药开始持续至子代断乳（通常大鼠为出生后第21天，小鼠为第28天）。

二、 核心检测项目

该试验的核心在于对亲代动物（P代）和子代动物（F1代）进行多阶段、多指标的观察和检测：

(一) 亲代动物（P代）检测项目

1. 一般毒性指标：

   • 临床观察： 每日至少一次，记录外观、行为、活动水平、神经毒性症状（震颤、抽搐、麻痹等）、分泌物、排泄物等异常。
   • 体重及体重变化： 所有亲代动物（雄性和雌性）在给药前、给药期间（如每周）、分娩前（雌性）定期称重。体重变化是反映全身毒性的敏感指标。
   • 摄食量： 定期测定（如每周），评估受试物对食欲和营养状况的影响。
   • 死亡率： 记录所有死亡动物及死亡时间。

2. 生殖系统特异性指标：

   • 雄性：
     • 睾丸、附睾、精囊、前列腺重量： 试验结束时处死动物，解剖称重。重量变化提示对性腺或附属腺体的影响。
     • 睾丸组织病理学检查： 核心项目！ 显微镜下评估生精小管结构（直径、上皮细胞层数）、生精细胞（精原细胞、精母细胞、精子细胞）的形态和数量、间质细胞（Leydig细胞）状态、管腔内精子数量等。这是评估精子发生障碍的最直接证据。
     • 附睾组织病理学检查： 评估附睾管结构及管腔内精子的形态和数量。
     • 精子分析（可选但推荐）： 附睾尾精子计数、精子活力（活动精子比例）、精子形态学分析（畸形率）。
   • 雌性：
     • 卵巢、子宫重量： 试验结束时称重。
     • 卵巢组织病理学检查： 核心项目！ 评估各级卵泡（原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡、成熟卵泡）和黄体的数量及形态。观察有无卵泡闭锁增加、黄体退化异常等。
     • 子宫检查： 观察大体形态（大小、颜色、有无病变）及着床痕（分娩或处死后计数）。着床痕计数是评估胚胎早期死亡的重要指标。
     • 动情周期观察（可选）： 在给药期和交配前，通过阴道涂片确定雌性动物的动情周期阶段及规律性，评估对内分泌和卵巢功能的影响。

3. 交配与生育力指标：

   • 交配率： （成功交配的雌性数 / 参与交配的雌性总数）* 100%。反映受试物对性行为的影响。
   • 受孕率/生育率： （妊娠雌性数 / 成功交配的雌性数）* 100%。反映成功受孕的能力。
   • 交配至受孕时间： 从开始同笼到发现受孕证据（如阴栓、精子）的天数。

4. 妊娠期指标：

   • 妊娠期体重增长： 妊娠雌性在妊娠期特定时间点（如GD 0, 6, 12, 18）称重，计算净增重（扣除子宫内容物重）。
   • 妊娠期： 记录从受孕到分娩的天数。延长或缩短可能提示毒性。

(二) 子代动物（F1代）检测项目

1. 出生前/分娩指标：

   • 黄体数： 雌性处死后计数卵巢上的黄体数，代表排卵数。
   • 着床数： 子宫内着床位点数（包括活胎、死胎、吸收胎的着床痕）。
   • 活胎数： 分娩时或剖宫产时具有生命迹象（呼吸、心跳、自主运动）的胎仔数。
   • 死胎数： 分娩时或剖宫产时已死亡的胎仔数。
   • 吸收胎/早期死亡胚胎数： 仅见着床痕或胎盘/胚胎残迹，无法辨别形态的胚胎数。反映着床后、器官形成前的胚胎丢失。
   • 着床前丢失率： （黄体数 - 着床数）/ 黄体数 * 100%。
   • 着床后丢失率： （着床数 - 活胎数）/ 着床数 * 100%。
   • 胎仔性别比： 活胎中雄性与雌性的比例。

2. 胎仔外观畸形检查（通常在分娩日进行）：

   • 核心项目！ 对所有胎仔（活胎、死胎）进行系统的外部检查。
   • 检查部位： 全身大小比例、头面部（颅骨、眼、耳、鼻、腭裂）、躯干（脊柱弯曲、脐疝）、四肢（缺失、短小、并趾/指、多趾/指、弯曲）、尾部（短尾、卷尾、无尾）、肛门闭锁、皮肤（水肿、出血、溃疡）、生殖器等。
   • 记录： 详细记录所有观察到的畸形类型、部位和严重程度。

3. 胎仔内脏畸形检查（通常在分娩日对部分胎仔进行）：

   • 核心项目！ 通常采用Wilson’s切片法或显微解剖法。
   • 检查系统： 颅腔及脑、胸腔（心、肺）、腹腔（肝、胃、肠、脾、肾、膀胱、生殖腺）。重点观察器官的位置、大小、形状、结构有无异常（如心室间隔缺损、肾积水、睾丸未降等）。

4. 胎仔骨骼畸形检查（通常在分娩日对部分胎仔进行）：

   • 核心项目！ 胎仔经固定、透明、茜素红染色后检查。
   • 检查部位： 颅骨（囟门大小、骨化中心）、胸骨（节数、骨化）、肋骨（数目、分叉、融合）、脊柱（椎体、椎弓的数目、形状、骨化）、四肢骨（长骨长度、形状、骨化程度）、掌/跖骨、指/趾骨。
   • 记录： 骨化延迟（骨化点缺失或小）、额外骨化点、骨形状异常（如波浪肋）、融合、缺失等。

5. 出生后子代生长发育指标：

   • 窝重： 出生当天（PND 0）及特定日龄（如PND 4, 7, 14, 21）称量整窝子代体重。
   • 个体体重： 特定日龄（如PND 0, 4, 7, 14, 21）称量每只子代体重。
   • 生存力指数： （PND 4存活数 / PND 0存活数）* 100%。评估哺乳早期存活情况。
   • 哺育指数： （PND 21存活数 / PND 4存活数）* 100%。评估哺乳期存活情况。
   • 睁眼时间： 记录双眼完全睁开的天龄。反映神经发育成熟度。
   • 出毛时间： 记录全身被毛长齐的天龄。反映生理发育。
   • 睾丸下降（雄性）： 记录睾丸完全降入阴囊的天龄。
   • 阴道张开（雌性）： 记录阴道口完全张开的天龄。
   • 断乳前神经行为发育简易测试（可选）： 平面翻正反射、负趋地性反射、悬崖回避反射等。

6. 出生后子代功能与行为测试（可选，更深入评估）：

   • 断乳后生长发育： 继续监测体重至性成熟。
   • 性成熟标志： 包皮分离（雄性）、阴道开口（雌性）的时间。
   • 感觉运动功能测试： 活动度、转棒实验等。
   • 学习记忆能力测试： 如迷宫实验等。
   • 生殖能力测试（F1代自交）： 评估受试物对子代生育力的潜在影响（即第二代效应）。

三、 数据分析与结果解读

• 对所有量化数据进行统计学分析（如ANOVA， Dunnett’s test等），比较各剂量组与对照组之间的差异显著性。
• 定性数据（如畸形、组织病理学改变）需进行发生率比较。
• 关键点： 识别受试物是否引起：
  • 亲代动物的全身毒性或生殖器官毒性（如精子发生障碍、卵泡闭锁增加）。
  • 生育力下降（交配率、受孕率降低）。
  • 胚胎-胎仔毒性（着床前/后丢失增加、死胎）。
  • 发育毒性/致畸性： 胎仔结构畸形（外观、内脏、骨骼）、生长发育迟缓（体重、体长）、功能缺陷（出生后发育指标异常）。
• 确定 无明显有害作用剂量水平 (NOAEL) 和 最低可见有害作用剂量水平 (LOAEL)。

结论：

生殖/发育毒性筛选试验通过上述系统而全面的检测项目，能够有效地识别受试物对哺乳动物生殖系统、胚胎发育和子代生长发育的潜在有害效应。它为后续更深入的分段生殖毒性试验（如ICH S5(R3)指南中的生育力与早期胚胎发育毒性试验、胚胎-胎仔发育毒性试验、围产期发育毒性试验）提供重要的初步依据，并为化学品的安全性评价和风险管理决策提供关键数据支撑。重点关注的检测项目包括亲代生殖器官组织病理学、着床前后丢失率、胎仔的外观畸形、内脏畸形和骨骼畸形检查，以及子代出生后的生长发育和生存力指标。