非酒精性脂肪肝模型

非酒精性脂肪肝模型：核心检测项目详解

构建可靠的非酒精性脂肪肝（NAFLD）模型是研究疾病机制和筛选潜在疗法的基石。模型成功与否，依赖于系统、多层次的检测评估。以下详述模型验证与表型评估的关键检测项目：

一、 基础形态学与组织病理学评估（金标准）

1. 大体观察与肝脏指数：

   • 项目： 处死后迅速分离肝脏，称取湿重；记录动物体重。
   • 检测方法： 精确称量。
   • 意义： 计算肝脏指数（肝重/体重 × 100%）。NAFLD模型通常伴随显著的肝脏肿大（肝重↑）和肝脏指数升高，直观反映肝脂质沉积和/或炎症水肿。
   • 操作要点： 操作迅速，避免组织脱水影响重量。

2. 组织学染色（核心确诊手段）：

   • 项目：
     • 苏木精-伊红染色： 常规评估肝脏整体结构、肝细胞形态（气球样变）、炎症细胞浸润（灶状坏死）、基本脂滴分布。
     • 油红O染色： 特异性染色中性脂肪（甘油三酯和胆固醇酯）。
   • 检测方法： 石蜡切片（H&E），新鲜肝脏组织冷冻切片（油红O最佳），显微镜观察并评分。
   • 意义：
     • H&E： 评估脂肪变性程度（肝细胞脂肪空泡面积占比）、肝细胞损伤（气球样变）、小叶内炎症（根据炎症细胞数量与分布评分），是NAFLD活动度评分（NAS）的基础。
     • 油红O： 直观、定量（通过图像分析软件）评估肝细胞内脂质沉积的程度和分布（红色阳性信号），检出灵敏度高于H&E。 是确认模型脂肪变性的最直接证据。
   • 操作要点： 油红O染色需用未固定或短暂固定的新鲜冷冻组织，石蜡包埋会溶解脂质导致假阴性。需由有经验的病理学家进行盲法评分（如NAS评分系统）。

二、 肝功能与脂质代谢生化指标

1. 血清肝功能标志物：

   • 项目： 丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、总胆红素、直接胆红素、白蛋白、总蛋白。
   • 检测方法： 动物血清，使用自动生化分析仪检测。
   • 意义： 反映肝细胞损伤程度（ALT、AST↑）、胆汁淤积可能（ALP、GGT、胆红素↑）及肝脏合成功能（白蛋白、总蛋白）。NAFLD/NASH模型常见ALT、AST轻中度升高。
   • 操作要点： 取血前适当禁食，离心分离血清需及时、低温。

2. 血清/肝脏脂质谱：

   • 项目：
     • 血清： 甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、游离脂肪酸。
     • 肝脏： 肝脏总甘油三酯含量、肝脏总胆固醇含量（关键指标）。
   • 检测方法：
     • 血清：自动生化分析仪。
     • 肝脏： 称取定量肝组织，使用氯仿-甲醇等有机溶剂提取总脂质，通过酶法或化学法测定提取物中的TG和TC含量（单位：mg/g 肝组织湿重）。
   • 意义：
     • 血清脂质： 反映全身脂代谢状态，模型动物常伴高甘油三酯、高胆固醇血症。
     • 肝脏TG/TC含量： 直接定量评估肝脏脂质堆积的核心生化指标。 成功模型该值显著高于对照组。
   • 操作要点： 肝脏组织脂质提取是关键步骤，需严格标准化操作保证提取效率。结果需用肝组织湿重标准化。

3. 糖代谢相关指标：

   • 项目： 空腹血糖、空腹胰岛素、口服葡萄糖耐量试验、胰岛素耐量试验、计算胰岛素抵抗指数（如HOMA-IR）。
   • 检测方法： 血糖仪（血糖），ELISA或化学发光法（胰岛素），计算。
   • 意义： NAFLD与胰岛素抵抗密切相关。评估模型是否伴随糖代谢异常及其程度。
   • 操作要点： 试验前需按要求严格禁食。OGTT/ITT需精确控制时间点。

三、 炎症与氧化应激指标

1. 血清/肝脏炎症因子：

   • 项目： 肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6、白细胞介素10等。
   • 检测方法： ELISA、Luminex等多因子检测技术。
   • 意义： 反映系统性及肝脏局部炎症状态（促炎因子↑，抗炎因子↓），是NASH的重要特征。
   • 操作要点： 样本处理避免反复冻融。选择已验证适用种属的试剂盒。

2. 肝脏氧化应激标志物：

   • 项目：
     • 促氧化： 丙二醛含量（反映脂质过氧化）、活性氧水平。
     • 抗氧化： 超氧化物歧化酶活性、谷胱甘肽过氧化物酶活性、总抗氧化能力。
   • 检测方法： 分光光度法、荧光法、ELISA（部分指标）。
   • 意义： 评估模型中线粒体功能障碍和氧化应激水平，参与肝细胞损伤和炎症。
   • 操作要点： 肝脏组织需快速处理（液氮速冻）并低温保存，避免氧化应激状态改变。

四、 纤维化评估（针对进展至NASH模型）

1. 组织学染色：

   • 项目： Masson三色染色、天狼星红染色。
   • 检测方法： 石蜡切片，显微镜观察。
   • 意义： 胶原纤维特异性染色（Masson染蓝色/绿色，天狼星红染红色）。 定量（图像分析）或半定量（评分系统，如Ishak评分）评估肝纤维化程度（胶原沉积的量与分布）。
   • 操作要点： 染色标准化。偏振光显微镜下观察天狼星红染色可区分I/III型胶原。

2. 血清纤维化标志物：

   • 项目： 透明质酸、III型前胶原氨基端肽、IV型胶原、层粘连蛋白等。
   • 检测方法： ELISA。
   • 意义： 间接反映细胞外基质代谢和纤维化活动度，可作为无创或辅助监测指标。升高提示纤维化进展可能。
   • 操作要点： 了解不同标志物的意义和局限性。

五、 其他重要评估

1. 基因与蛋白表达分析：

   • 项目： 脂质合成相关基因、脂肪酸氧化相关基因、炎症因子、纤维化相关基因等的mRNA（qRT-PCR）和蛋白（Western Blot, IHC）表达水平。
   • 意义： 深入探究模型发生的分子机制，验证药物干预靶点。
   • 操作要点： 严格RNA/DNA提取流程，引物/抗体特异性验证。

2. 肝脏病理综合评分系统：

   • 项目： NAFLD活动度评分（NAS：脂肪变+小叶炎症+肝细胞气球样变）、SAF评分（脂肪变+活动度）、纤维化分期评分。
   • 意义： 对组织病理学改变进行全面、标准化的半定量评估，是判断模型阶段（单纯脂肪变vs NASH）和严重程度的金标准。
   • 操作要点： 必须由经验丰富的肝脏病理学家进行盲法阅片评分。

检测策略建议：

• 基础必备： 肝脏指数、肝脏组织学（H&E + 油红O）、肝脏TG/TC含量、血清ALT/AST指标。
• 进阶评估：
  • 评估NASH：增加炎症因子、氧化应激指标、纤维化染色（天狼星红/Masson）及评分。
  • 评估代谢表型：增加糖耐量、胰岛素耐量、血清脂质全套。
• 机制探究： 基因和蛋白表达分析。

总结： 建立一个可靠的非酒精性脂肪肝模型，其评价体系必须多层次、多角度。肝脏组织病理学（特别是油红O染色和NAS/SAF评分）结合肝脏脂质含量（TG/TC）测定是确认模型成功及评估脂肪变性严重度的核心。 在此基础上，根据研究目标（单纯脂肪变模型 vs NASH模型 vs NASH伴纤维化模型），系统性地纳入肝功能、代谢指标、炎症、氧化应激以及纤维化相关的检测项目，方能全面、准确地刻画模型表型，为后续研究奠定坚实的科学基础。所有检测应严格遵守标准化操作规程，确保结果的可重复性和可靠性。动态监测不同时间点的指标变化对于理解疾病进展也尤为重要。