干眼症模型(大鼠)

大鼠干眼症模型：核心检测项目详解

构建可靠的大鼠干眼症模型是研究疾病机制和治疗策略的关键。以下重点阐述模型构建后用于评估干眼症严重程度和机制的核心检测项目，涵盖临床体征、组织病理学和分子生物学等多层次评价体系：

一、 基础泪液分泌功能评估 (核心指标)

1. 酚红棉线试验：

   • 检测对象： 泪液基础分泌量。
   • 方法： 将校准的酚红浸染棉线置于大鼠下眼睑中外1/3结膜囊内，保持规定时间（通常5分钟）。
   • 指标： 测量棉线被泪液湿润并变红的长度（毫米）。干眼模型组显著低于正常对照组。

2. 泪膜破裂时间：

   • 检测对象： 泪膜稳定性。
   • 方法： 在角膜表面滴加少量荧光素钠，在裂隙灯钴蓝光下观察，记录最后一次眨眼到角膜表面出现第一个随机分布的干燥斑所需的时间（秒）。
   • 指标： 干眼模型组BUT显著缩短。

二、 眼表结构与损伤评估

1. 角膜荧光素钠染色：

   • 检测对象： 角膜上皮细胞损伤程度。
   • 方法： 角膜表面滴加荧光素钠，生理盐水冲洗后，在裂隙灯钴蓝光下观察并评分。
   • 评分标准： 通常将角膜划分为多个区域（如4象限），根据着染点（绿色）的密度和形态进行评分（如0-3分/区，总分0-12分）。干眼模型组评分显著增高。

2. 虎红/丽丝胺绿染色：

   • 检测对象： 结膜及角膜失活/受损的上皮细胞（尤其对结膜更敏感）。
   • 方法： 眼表滴加染色剂，生理盐水冲洗后观察结膜和角膜着染情况并评分（类似荧光素评分）。
   • 指标： 评估结膜上皮损伤和泪液粘蛋白层异常。

3. 眼表炎症指数观察：

   • 检测对象： 结膜充血、水肿、分泌物等炎症体征。
   • 方法： 在裂隙灯白光下观察并分级评分（通常0-3级）。
   • 指标： 干眼模型常伴有轻度至中度结膜炎症。

三、 泪腺与眼表组织病理学评估

1. 组织学染色 (H&E)：

   • 检测对象： 泪腺组织结构、腺泡和导管形态、炎症细胞浸润程度。
   • 方法： 取泪腺、眼球（含角膜、结膜）组织固定、包埋、切片，进行H&E染色。
   • 指标： 干眼模型可见泪腺腺泡萎缩、空泡化、导管扩张、间质纤维化、淋巴细胞等炎症细胞浸润；结膜杯状细胞密度可能减少，角膜上皮可能增厚或变薄、不规则。

2. 过碘酸希夫染色：

   • 检测对象： 结膜杯状细胞数量与密度。
   • 方法： 结膜组织切片进行PAS染色，杯状细胞呈紫红色。
   • 指标： 干眼模型组结膜杯状细胞数量显著减少。

3. 免疫组织化学/免疫荧光染色：

   • 检测对象：
     • 炎症标志物： CD3, CD4, CD8, CD45, CD68, F4/80 (淋巴细胞、巨噬细胞浸润)，IL-1β, IL-6, TNF-α等炎性细胞因子表达。
     • 凋亡标志物： Caspase-3, TUNEL染色（检测原位凋亡细胞）。
     • 增殖标志物： Ki-67 (评估上皮修复状态)。
     • 粘蛋白： MUC5AC (主要结膜杯状细胞分泌)。
   • 方法： 在组织切片上使用特异性一抗结合显色或荧光二抗进行标记。
   • 指标： 定量或半定量分析目标蛋白在泪腺、角膜、结膜组织中的表达水平或阳性细胞数量。

四、 泪液与组织炎症因子检测

1. 泪液样本采集与成分分析：
   • 方法： 用微量毛细管或吸收材料小心收集泪液（避免刺激引起反射性分泌）。
   • 检测对象：
     • 炎性因子浓度： 使用基于免疫学原理的定量检测方法（如酶联免疫吸附试验、多重微球免疫分析法）测量泪液中IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-γ等关键促炎因子浓度。干眼模型显著升高。
     • 渗透压： 使用专用微量渗透压计测量泪液渗透压。干眼模型通常升高。

五、 角膜敏感度评估 (可选，反映神经功能)

1. 角膜机械感觉阈值测定：
   • 检测对象： 角膜神经敏感性。
   • 方法： 使用校准的尼龙单丝（不同直径代表不同受力）轻柔接触大鼠角膜中央，记录引起反射性眨眼的最小受力阈值（通常以力或弯曲长度表示）。
   • 指标： 干眼模型可能出现角膜敏感性下降（神经病变）或升高（炎症刺激）。

六、 细胞凋亡检测

1. TUNEL 染色：
   • 检测对象： 泪腺腺泡细胞、角膜上皮细胞、结膜上皮细胞的凋亡情况。
   • 方法： 在组织切片上进行原位末端标记，凋亡细胞核呈阳性染色（通常为绿色荧光或显色）。
   • 指标： 定量分析阳性细胞数量或比例。干眼模型组凋亡细胞显著增多。

七、 氧化应激水平检测 (可选)

1. 泪液或组织匀浆检测：
   • 检测对象：
     • 抗氧化酶活性： 超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶。
     • 氧化损伤产物： 丙二醛。
   • 方法： 使用生化比色法或专用试剂盒进行定量。
   • 指标： 干眼模型常显示抗氧化酶活性降低，氧化损伤产物增加。

模型验证要点：

• 对照设置： 必须设置正常未处理的对照组（Naïve Control）和/或溶剂/载体对照组（Vehicle Control）。
• 时序检测： 根据研究目的，在不同时间点（如造模后1周、2周、4周等）进行动态检测，观察疾病进展或治疗效果。
• 指标组合： 选择上述多个维度的指标进行综合评价，尤其基础泪液分泌量（酚红棉线）、角膜荧光素染色评分、泪腺组织病理学炎症/损伤评分、泪液炎性因子水平是评估干眼模型是否成功及其严重程度的最常用和核心指标。

通过这一系列系统性的检测项目，可以全面、客观地评价大鼠干眼症模型的表型特征、炎症状态和组织病理变化，为深入研究干眼症的发病机制和筛选潜在治疗方法奠定坚实基础。