被动皮肤过敏反应（PCA）(小鼠/大鼠)

发布时间：2025-06-10 08:19:14 阅读量：5 作者：生物检测中心

被动皮肤过敏反应（PCA）（小鼠/大鼠）检测项目详解

被动皮肤过敏反应（Passive Cutaneous Anaphylaxis, PCA）是研究Ⅰ型超敏反应（速发型超敏反应）的经典体内动物模型，主要用于评估抗原诱导的、由特定抗体（主要是IgE，有时也可为IgG亚类如IgG1）介导的局部急性炎症反应。以下重点介绍其实验流程中的核心检测项目：

一、 核心检测项目

  1. 血清/抗体致敏能力检测：

    • 目的： 评估特定血清样本（含潜在致敏性抗体，如针对目标抗原的IgE/IgG1）能否成功致敏皮肤肥大细胞。
    • 方法： 将待测血清（或含特异性抗体的样品）进行系列稀释。通常采用背部皮肤皮内注射法，将不同稀释度的血清（如50μl/点）注射入受体动物（小鼠或大鼠）已剃毛的背部皮肤真皮层内。
    • 关键项目：
      • 致敏抗体滴度测定： 确定能够诱发阳性PCA反应的最低血清稀释度（或最高稀释倍数的倒数）。滴度越高，表明血清中致敏性抗体的浓度和/或亲和力越强。
      • 致敏潜伏期观察： 记录注射血清后到激发抗原前的时间间隔（通常数小时至72小时不等，IgE介导常选48-72小时）。此期间致敏抗体需结合到局部肥大细胞和嗜碱性粒细胞的Fc受体上。

  2. PCA反应激发与局部炎症评估：

    • 目的： 静脉注射抗原和染料混合液，诱导局部肥大细胞脱颗粒，并通过染料渗漏可视化及量化血管通透性增加的程度。
    • 方法：
      • 激发： 致敏期结束后，经尾静脉注射含抗原（与致敏抗体对应的特异性抗原）和伊文思蓝（Evans Blue）染料（常用剂量：0.5%-1%溶液，按体重计算，小鼠约100-200μl，大鼠约1ml）的生理盐水混合液。
      • 反应时间： 激发后通常在30-60分钟（IgE介导）或2-4小时（某些IgG介导）处死动物，此时染料渗漏达到高峰。
    • 核心检测项目：
      • 蓝斑直观观察与定性评估：
        • 剥离背部皮肤，观察注射血清部位（皮丘区域）是否有肉眼可见的蓝色染料渗出斑（蓝斑）。
        • 阳性结果判定： 蓝斑的出现即为PCA阳性反应，表明该注射点存在致敏抗体结合并触发了肥大细胞脱颗粒。
        • 初步强度评估： 根据蓝斑的大小、颜色的深浅（深蓝 > 浅蓝）进行初步的强弱比较（需结合定量）。
      • 蓝斑直径测量：
        • 使用游标卡尺或图像分析软件精确测量蓝斑的最大直径（mm）。直径越大，通常反映局部血管通透性增加越显著。
      • 染料渗出量定量检测（关键定量指标）：
        • 方法： 在蓝斑反应高峰处死动物后，仔细剪下含蓝斑的皮肤组织（通常连同少量周围组织一起剪下，保证包含整个蓝斑），置于含适当溶剂（如甲酰胺、1%十二烷基硫酸钠SDS溶液、或丙酮-生理盐水混合液）的试管中。
        • 萃取： 在特定温度（如37°C或60°C）下孵育一定时间（数小时至过夜），将组织中结合的伊文思蓝染料充分萃取溶解到溶剂中。
        • 比色定量：
          • 离心去除组织碎片，取上清液。
          • 使用分光光度计在特定波长（通常伊文思蓝在610-620nm处有最大吸收峰）下测定萃取液的吸光度（OD值）。
          • 计算： 根据预先建立的伊文思蓝标准曲线（已知浓度染料在相同溶剂中的OD值），将样品OD值换算成染料含量（μg/蓝斑或μg/皮肤片）。该数值直接反映局部血管通透性增加的程度，是PCA反应强度的最重要定量指标。

二、 延伸或关联检测项目（根据研究目的可选）

  1. 血清中特异性抗体水平定量：

    • 目的： 明确致敏血清中引起PCA反应的关键抗体（如抗原特异性IgE、IgG1）的浓度，与PCA反应强度进行相关性分析。
    • 方法： 通常采用酶联免疫吸附试验（ELISA），使用商品化试剂盒或自建方法检测致敏血清中目标抗原特异性IgE、IgG1等的浓度（ng/ml或U/ml）。
    • 意义： 将血清抗体滴度与PCA反应的染料渗出量关联，验证抗体在PCA中的主导作用，并评估不同处理对抗体产生的影响。

  2. 肥大细胞脱颗粒相关介质检测（可选，更深入机制研究）：

    • 目的： 直接检测PCA反应部位肥大细胞脱颗粒释放的关键介质水平。
    • 样本： 反应部位的皮肤组织匀浆液或灌洗液。
    • 检测项目：
      • 组胺（Histamine）： 肥大细胞脱颗粒的核心介质，可用荧光法、ELISA或高效液相色谱法（HPLC）检测。
      • 蛋白酶（如类胰蛋白酶 Tryptase, 糜蛋白酶 Chymase, 其他肥大细胞特异性蛋白酶）： 可用酶活性测定或免疫学方法（ELISA, Western Blot）检测。
      • 细胞因子/趋化因子： 如TNF-α, IL-4, IL-6, IL-13等，可用ELISA或基于微球的免疫检测法（如Luminex）检测。反映炎症反应的放大和持续。
    • 意义： 更直接地证实肥大细胞活化状态，并分析释放介质的谱系，深入了解PCA反应的炎症特征。

  3. 组织学检查（病理学评估）：

    • 目的： 观察PCA反应部位的组织病理学变化。
    • 方法： 取反应部位皮肤组织进行固定、包埋、切片、染色（常用HE染色观察整体炎症细胞浸润和血管变化；甲苯胺蓝或阿尔新蓝染色特异性观察肥大细胞数量、分布及脱颗粒状态）。
    • 评估项目：
      • 肥大细胞脱颗粒程度（脱颗粒细胞比例）。
      • 血管扩张、充血情况。
      • 局部水肿程度。
      • 炎症细胞（嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞等）浸润的数量和类型。
    • 意义： 提供PCA反应形态学证据，补充肉眼观察和染料定量信息，评估炎症的性质和强度。

三、 结果解读关键点

  • 阳性对照与阴性对照： 实验必须设立明确的阳性对照（如已知致敏能力的抗血清+对应抗原）和阴性对照（如正常动物血清+抗原，或致敏血清+无关抗原/PBS）。只有阳性对照出现强蓝斑，阴性对照无蓝斑或蓝斑极弱时，实验结果才可靠。
  • 剂量依赖性： 通常，血清致敏稀释度越高（抗体浓度越低），PCA反应（蓝斑大小、染料渗出量）越弱。抗原激发剂量在一定范围内也呈现剂量依赖效应。
  • 抗体类型： 经典的PCA反应主要由IgE介导（潜伏期长，48-72小时）。某些物种（如小鼠、大鼠）的IgG亚类（如IgG1）在特定条件下也能介导PCA（通常潜伏期较短，反应强度可能较弱）。需通过抗体亚型检测或使用特异性抗体耗竭实验来确认主导抗体类型。
  • 定量是关键： 肉眼观察蓝斑大小和颜色深浅是初步判断，但染料渗出量的定量检测（比色法）是评估PCA反应强度的最客观、可重复性最高的金标准。

四、 注意事项

  • 动物福利与伦理： 实验需遵循动物实验伦理规范，获得相关委员会批准，尽量减少动物痛苦。
  • 操作一致性： 皮内注射深度、体积、激发抗原/染料的浓度和体积、激发后到取材的时间等需严格控制一致。
  • 背景渗漏： 注射操作本身可能造成轻微渗漏，需注意区分非特异性损伤与特异性PCA反应。阴性对照至关重要。
  • 染料选择与定量： 伊文思蓝最常用，萃取方法和溶剂会影响定量结果，需优化并保持方法稳定。标准曲线必须每次制备或验证。
  • 模型局限性： PCA是局部反应模型，不能完全模拟全身性过敏反应（如过敏性休克）。

综上，被动皮肤过敏反应（PCA）实验的核心检测项目聚焦于“血清致敏能力”（滴度测定）和“激发后的局部炎症反应”（蓝斑观察、直径测量及最关键的染料渗出量定量）。 根据研究需求，可进一步延伸至特异性抗体定量、炎症介质检测和组织病理学分析，以全面评估Ⅰ型超敏反应的体内发生机制和强度。严谨的操作规范和合理的对照设置是获得可靠结果的基础。