组胺诱导的急性瘙痒模型(小鼠)

组胺诱导急性瘙痒模型（小鼠）实验方案

一、模型建立

1. 动物准备

   • 选用成年C57BL/6小鼠（雌雄各半或同性别），体重18-25g
   • 适应性饲养≥7天，温度23±2℃，12h昼夜循环，自由进食饮水
   • 实验前24h剃除颈背部毛发（面积约2×2cm）

2. 致痒剂注射

   • 组胺溶液：0.1%组胺二盐酸盐（溶于无菌生理盐水）
   • 注射方式：皮下注射50μl于剃毛区
   • 对照组：同体积生理盐水注射

二、核心检测项目

(1) 瘙痒行为学定量（关键指标）

• 直接观察法（双盲设计）

  • 记录时段：注射后0-30min
  • 定义行为：单次抓挠 = 后爪连续接触注射区域≥0.5秒
  • 检测参数：
    • 总抓挠次数
    • 首次抓挠潜伏期（秒）
    • 抓挠发作次数（连续抓挠≥3次为1次发作）

• 自动监测系统（可选）

  • 使用高帧率摄像头记录行为
  • 通过AI算法识别抓挠动作（需预训练模型）

(2) 神经激活标志物检测

• 脊髓c-Fos免疫组化

  • 取材时间：注射后90min（峰值表达期）
  • 检测区域：颈段脊髓（C6-C8）
  • 方法：
    1. 4%多聚甲醛灌注固定
    2. 冰冻切片（厚度30μm）
    3. 抗c-Fos一抗（兔源）4℃孵育过夜
    4. 荧光二抗标记，共聚焦显微镜计数阳性神经元

• 背根神经节（DRG）基因表达

  • qRT-PCR检测瘙痒相关基因： TRPV1、TRPA1、MrgprA3、NPPB
  • RNA提取：TRIzol法分离DRG总RNA

(3) 皮肤神经末梢反应

• 肥大细胞脱颗粒分析

  • 甲苯胺蓝染色皮肤组织切片
  • 计数脱颗粒肥大细胞比例（≥50%颗粒释放为阳性）

• P物质（SP）释放检测

  • 免疫荧光染色皮肤切片
  • 抗SP抗体标记C纤维末梢，量化荧光强度

(4) 炎性介质检测

• 皮肤组织匀浆液分析
  • ELISA检测：
    • 组胺（验证局部浓度）
    • 白介素-31（IL-31）
    • 胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP）
  • 取样时间：注射后60min

三、验证实验设计

四、关键注意事项

1. 环境控制

   • 行为学测试需在隔音室进行，光照强度≤50 lux
   • 观察者需提前训练至行为判断一致性>90%

2. 时间窗口

   • 组胺诱导瘙痒呈双相峰：
     • 早期相（0-10min）：直接神经激活
     • 晚期相（20-40min）：炎性介质协同作用

3. 排除干扰因素

   • 注射时避免损伤皮肤
   • 剔除自发皮炎个体
   • 注射后立即转移至观察笼（避免残留气味干扰）

五、预期结果

1. 行为学：组胺组抓挠次数显著高于盐水组（*p<0.01），阳性药组显著抑制
2. 分子层面：
   • 脊髓c-Fos阳性神经元增加2-3倍
   • DRG中TRPV1/TRPA1 mRNA表达上调
   • 皮肤IL-31浓度与抓挠次数呈正相关（r>0.7）

本方案符合动物伦理规范（需获得IACUC批准），检测项目聚焦瘙痒的神经免疫机制，数据可重复性强，适用于抗瘙痒药物筛选及机制研究。