酒精性脂肪肝病动物模型（小鼠/大鼠）构建与核心检测项目详解

一、模型简介

酒精性脂肪肝病（AFLD）是长期过量饮酒导致的肝脏病理改变，初期表现为肝细胞脂肪变性（脂肪肝），可进展为酒精性肝炎、纤维化甚至肝硬化。为研究其发病机制及干预措施，常使用小鼠或大鼠构建AFLD模型。

常用造模方法：

1. Lieber-DeCarli液体饲料法（最经典）：

   • 给予含乙醇（通常占热量的25%-36%）的液体饲料，对照组给予等热量麦芽糖糊精替代乙醇。
   • 优点：可精确控制营养摄入，避免营养不良干扰；模拟慢性饮酒过程。
   • 周期：通常4-8周可诱导显著脂肪变性。

2. Gao-Binge模型（慢性+急性暴饮）：

   • 先以Lieber-DeCarli饲料喂养（慢性），最后1-2天灌胃单次高剂量乙醇（5g/kg，小鼠）。
   • 优点：模拟临床“慢性饮酒+急性酗酒”，可诱导更明显的炎症和肝损伤。

3. 乙醇灌胃法：

   • 每日定时灌胃一定浓度乙醇溶液（如30%-50% v/v），需严格配对喂养（等热量对照）。
   • 缺点：操作繁琐，易导致胃黏膜损伤、动物应激。

二、核心检测项目详解（重点）

以下检测项目按病理进程分层，涵盖从脂肪变性到炎症、氧化应激、纤维化的关键指标。

1. 肝脏大体形态与重量

• 检测指标：
  • 肝指数（Liver Index）: 肝重/体重 × 100%
  • 肝脏外观（拍照记录）：颜色（是否苍白、油腻）、质地（是否脆软）。
• 意义：脂肪肝常表现为肝肿大、肝指数升高，肝脏呈黄白色、油腻感。

2. 血清生化指标（肝功能 & 脂代谢）

• 必测指标：
  • ALT（丙氨酸氨基转移酶）、AST（天冬氨酸氨基转移酶）：肝细胞损伤的金标准。
  • TG（甘油三酯）、TC（总胆固醇）：反映血清脂质水平。
  • ALP（碱性磷酸酶）、TBIL（总胆红素）：评估胆汁淤积情况（中晚期）。
• 意义：ALT/AST升高提示肝损伤；血清TG/TC升高与肝脏脂质输出障碍相关。

3. 肝脏组织病理学（金标准）

• 检测技术：
  • H&E染色（苏木精-伊红染色）：评估脂肪变性程度、肝细胞气球样变、炎症浸润（如中性粒细胞）。
  • 油红O染色（Oil Red O Staining）：特异性染色肝细胞内中性脂肪（TG），直观显示脂滴分布与面积。
  • 天狼星红染色（Sirius Red Staining）：检测胶原沉积，评估纤维化程度（中晚期模型）。
• 病理评分标准：
  • 脂肪变性：根据脂滴占据肝细胞面积百分比分级（0-4级）。
  • 炎症活动度：根据炎症灶数量、浸润程度评分（如0-3级）。
  • 纤维化分期：常用Ishak或METAVIR评分系统（0-4期或0-6期）。

4. 肝脏脂质含量定量

• 检测方法：
  • 生化法：使用试剂盒（如GPO-PAP法）定量肝组织匀浆中 TG 和 TC 含量（单位：mg/g肝组织）。
  • TLC/GLC/HPLC：更精确分析脂质组成（如FFA、PL、CE等）。
• 意义：直接量化肝脏脂肪堆积程度，是评价模型成功的关键数据。

5. 氧化应激指标

• 核心指标：
  • MDA（丙二醛）：脂质过氧化终产物，反映氧化损伤程度。
  • SOD（超氧化物歧化酶）、GSH（谷胱甘肽）：重要抗氧化酶/物质，常显著降低。
  • ROS（活性氧）：可通过DCFH-DA探针在组织或细胞水平检测。
• 意义：乙醇代谢导致活性氧爆发，是AFLD核心发病机制之一。

6. 炎症因子与相关通路

• 检测方法：
  • qPCR/ELISA/WB：检测关键因子表达/含量：
    • 促炎因子：TNF-α, IL-1β, IL-6, MCP-1。
    • 炎症通路：TLR4/MyD88/NF-κB信号通路蛋白。
  • 免疫组化/免疫荧光：定位炎症因子表达位置（如Kupffer细胞）。
• 意义：酒精激活Kupffer细胞释放炎症因子，驱动肝炎进展。

7. 脂肪代谢相关基因与蛋白

• 关键靶点：
  • 脂肪合成：SREBP-1c, ACC, FASN, SCD1（表达上调）。
  • 脂肪分解：PPARα, CPT1A, ACOX1（表达下调）。
  • 脂肪转运：CD36, FATP（摄取增加）；MTTP, ApoB（输出减少）。
• 检测方法：qPCR, WB, IHC。
• 意义：揭示脂肪变性的分子机制（合成↑、氧化↓、输出↓）。

8. 纤维化标志物（中晚期模型）

• 检测指标：
  • 羟脯氨酸（Hyp）含量：胶原特有氨基酸，定量总胶原。
  • α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）：活化的肝星状细胞标志物（IHC/WB）。
  • 胶原蛋白：Col1a1, Col3a1（qPCR）；I型、III型胶原（IHC/Sirius Red）。
  • TGF-β1, TIMP-1, MMPs：纤维化关键调控因子。
• 意义：评估模型是否进展至纤维化阶段。

三、模型评价要点

1. 成功标志：

   • 肝指数显著升高
   • 血清ALT/AST明显升高
   • 肝组织H&E和油红O染色显示显著脂肪变性
   • 肝组织TG含量显著增加

2. 排除混杂因素：

   • 严格配对喂养：确保对照组摄入等热量、等营养（除乙醇外）。
   • 监测体重：避免模型组因摄食减少导致体重下降过快（Lieber-DeCarli法可避免）。

四、实验设计建议

• 动物选择：C57BL/6小鼠（最常用）、SD/Wistar大鼠。基因敲除/转基因鼠用于机制研究。
• 样本量：每组至少6-8只，减少个体差异影响。
• 取材保存：
  • 肝脏分装：速冻于-80℃（用于生化、分子实验）；10%福尔马林固定（用于病理切片）。
  • 血清/血浆：离心后-80℃保存。

五、总结

构建可靠的酒精性脂肪肝动物模型，需结合慢性乙醇暴露与精准营养控制。检测项目应多层次覆盖：

1. 功能水平（血清ALT/AST）
2. 形态水平（肝指数、H&E/油红O染色）
3. 生化水平（肝TG/TC、氧化应激指标）
4. 分子水平（脂肪代谢基因、炎症因子）

核心必检项：肝指数、血清ALT/AST、肝组织H&E染色、油红O染色、肝TG定量。 进阶研究：炎症因子、氧化应激、关键信号通路、纤维化标志物。

进一步研究方向：

• 探索肠道菌群-肝脏轴在AFLD中的作用
• 新型生物标志物（如外泌体miRNA）的发现
• 靶向脂代谢、炎症、纤维化的干预策略验证

此框架可根据具体研究目的（如机制探索、药物评价）调整检测重点。建议在预实验中优化造模周期和剂量，确保模型稳定可靠。

如您需要特定模型的详细Protocol（如Lieber-DeCarli饲料配方）、某个检测项目的实验方法细节或数据解读示例，欢迎进一步提问！