石蜡松香+丙酸睾酮局部涂抹诱发脱发模型(小鼠)

石蜡松香联合丙酸睾酮局部涂抹诱导小鼠脱发模型：建立与检测方案

摘要： 本研究详细描述了采用石蜡松香（Rosin）与丙酸睾酮（Testosterone Propionate, TP）联合局部涂抹建立小鼠脱发模型的方法，并重点阐述模型建立过程中及建成后的关键检测项目，为雄激素性脱发（Androgenetic Alopecia, AGA）等毛发疾病的研究提供可靠工具。

一、 模型建立方法

1. 动物选择： 成年雄性C57BL/6小鼠（6-8周龄），背部毛发处于生长期（皮肤呈粉红色）。
2. 备皮： 小鼠适应性饲养后，麻醉状态下使用电动剃毛器或脱毛膏（需彻底洗净残留）剃除背部特定区域（通常约2cm x 3cm）毛发，暴露皮肤。
3. 溶液配制：
   • 石蜡松香溶液：将石蜡松香溶解于适量有机溶剂（如丙酮、无水乙醇）中，配制成所需浓度（如 40-60% w/v）。充分溶解混匀。
   • 丙酸睾酮溶液：将丙酸睾酮溶解于无水乙醇或含适量促渗剂（如氮酮，浓度需优化）的溶液中，配制成所需浓度（如 5-10 mg/mL）。避光保存。
   • 联合涂抹剂： 临用前按比例（如 1：1）混合石蜡松香溶液与丙酸睾酮溶液，充分混匀。对照组使用相应体积的溶剂混合物。
4. 涂抹给药：
   • 每天在备皮区域定量（如 100 μL）均匀涂抹一次联合涂抹剂（或对照溶剂）。
   • 持续涂抹一定周期（通常14-21天）。涂抹期间密切观察小鼠皮肤反应（红肿、破损等）。
5. 饲养管理： 标准SPF级动物房饲养，自由饮水摄食，12小时光暗周期。严格遵守动物福利规定。

二、 核心检测项目（重点）

模型建立过程中及结束后，需通过以下多层次检测项目评估脱发效果及模型机制：

1. 宏观观察与毛发状态定量：

   • 肉眼观察与拍照记录： 每天或隔天观察并拍照记录涂抹区域皮肤颜色变化（生长期粉红 → 退行期灰暗 → 休止期苍白）及毛发脱落、稀疏情况。（关键直观指标）
   • 毛发剃毛再生延迟实验：
     • 在涂抹开始前或涂抹过程中（如第7天），将涂抹区域及邻近未涂区域的毛发完全剃净。
     • 后续定期（如每2-3天）拍照记录并对比涂抹区与未涂区（或对照鼠对应区）新毛发生长（肉眼可见黑色毛茬）的时间、密度和覆盖面积。
     • 计算毛发再生抑制率： 毛发再生抑制率 (%) = [(1 - 实验组再生面积或毛发密度 / 对照组再生面积或毛发密度)] × 100% （定量核心指标）
   • 毛发称重：
     • 在实验终点（或特定时间点），使用脱毛膏或胶带粘取法无损收集涂抹区域脱落的毛发。
     • 精密天平称量毛发总重量，与对照组进行比较。（直接定量脱发程度）

2. 组织病理学检测（金标准）：

   • 样本采集： 实验终点处死小鼠，取涂抹区域及对照区域（或对照鼠对应区域）全层皮肤组织，固定于10%中性福尔马林或Bouin's液中。
   • 石蜡包埋与切片： 常规脱水、透明、石蜡包埋，制作5-7 μm厚度的矢状切片。
   • 苏木精-伊红（H&E）染色：
     • 毛囊计数与分类： 在显微镜下（常用100-200倍视野），随机选择多个视野，计数单位长度皮肤（如每毫米）或单位面积内处于生长期（Anagen）、退行期（Catagen）、休止期（Telogen）的毛囊数量。计算各期毛囊比例（特别是休止期毛囊比例显著升高是脱发标志）。（核心微观指标）
     • 毛囊形态测量： 测量毛囊长度、毛球部大小、毛乳头直径等，评估毛囊微型化程度（AGA特征）。
     • 皮肤厚度与炎性浸润： 观察表皮和真皮层厚度变化，评估是否有炎症细胞浸润及其程度，排除石蜡松香引起的过度炎症干扰。
   • 特殊染色（可选）：
     • 马松三色染色： 观察真皮层胶原纤维的增生或重塑情况。
     • 天狼星红染色： 偏振光下区分I型和III型胶原，评估纤维化程度。

3. 分子生物学检测（机制探索）：

   • 组织样本采集： 实验终点取涂抹区域皮肤组织，迅速液氮冷冻后-80℃保存，用于提取RNA或蛋白质；或用RNA later保存用于RNA提取。
   • 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：
     • 靶基因： 检测与毛囊周期调控、雄激素信号通路、炎症反应相关基因的mRNA表达水平：
       • 雄激素受体 (AR)及其靶基因（如 SRD5A1, SRD5A2）
       • Wnt/β-catenin 通路关键基因（如 β-catenin, LEF1, Cyclin D1）
       • 毛囊干细胞标记物（如 CD34, KRT15, LGR5）
       • 凋亡相关基因（如 Bax, Bcl-2, Caspase-3）
       • 炎症因子（如 IL-1β, TNF-α, IL-6）
       • 转化生长因子（如 TGF-β1, TGF-β2）
   • 蛋白质免疫印迹（Western Blot）：
     • 靶蛋白： 检测上述关键通路中蛋白的表达水平及活化状态（磷酸化形式），如：
       • AR蛋白及其磷酸化形式
       • β-Catenin蛋白
       • 信号分子（如 p-AKT, p-ERK, p-STAT3）
       • 细胞周期蛋白（如 Cyclin D1）
       • 凋亡蛋白（Cleaved Caspase-3, Bcl-2/Bax比值）
   • 免疫组织化学（IHC）/免疫荧光（IF）：
     • 靶蛋白定位与表达： 在皮肤组织切片上进行染色，直观观察关键蛋白（如AR, β-Catenin, KRT15, Ki67增殖标记等）在毛囊不同部位（毛球、隆突部、外根鞘等）的定位和表达强度变化。可进行半定量分析（平均光密度/积分光密度）。（空间定位关键指标）
     • TUNEL染色： 检测毛囊细胞凋亡情况。

三、 模型特点与注意事项

• 机制模拟： 丙酸睾酮模拟体内雄激素（特别是DHT）作用，石蜡松香作为刺激物诱导局部轻度炎症并增强药物渗透，共同作用于毛囊，诱导体毛提前进入退行期和休止期，模拟AGA的毛囊微型化过程。
• 优势： 操作相对简便，成本较低，脱发效果相对稳定。
• 局限性/注意事项：
  • 局部炎症控制： 石蜡松香浓度过高或个体差异可能导致过度炎症反应，干扰脱发机制的解读。需优化浓度并密切观察。
  • 系统性影响： 局部高剂量睾酮可能部分吸收进入循环，产生轻微系统性雄激素效应（如前列腺增大），需注意。
  • 模型侧重： 该模型更侧重于诱导毛发脱落和维持休止期，对毛囊微型化的模拟程度可能不如遗传模型或长期模型深刻。
  • 动物福利： 严格遵守伦理规范，尽量减少动物痛苦。出现严重皮肤损伤应停止实验或人道处理。
  • 溶剂对照： 必须设立涂抹相应溶剂混合物的对照组，排除溶剂本身对皮肤和毛囊的影响。
  • 优化： 石蜡松香和丙酸睾酮的浓度比例、涂抹频率、周期需根据具体实验目的和动物品系进行预实验优化。

结论：

石蜡松香联合丙酸睾酮局部涂抹能有效诱导小鼠背部脱发，表现为毛发再生延迟、肉眼可见毛发稀疏、组织学上休止期毛囊比例显著升高以及毛囊微型化趋势。通过系统性的宏观观察（毛发再生、称重）、组织病理学（毛囊分期计数、形态测量）以及分子生物学检测（AR/Wnt通路、干细胞标记、炎症因子等），可全面评估模型的有效性并深入探究脱发的潜在分子机制。该模型为筛选促毛发生长药物和研究脱发发病机制提供了有价值的工具。应用中需注意控制局部炎症反应和设立严格的对照组。

参考文献： (示例，需根据实际引用文献补充)

1. Pan, H., et al. (2016). Establishment and evaluation of a mouse model of androgenetic alopecia. Experimental Animals, 65(4), 435-443.
2. Lolli, F., et al. (2017). Androgenetic alopecia: a review. Endocrine, 57(1), 9-17. (背景参考)
3. 张某某, 李某某. (20XX). 石蜡松香和丙酸睾酮诱导小鼠脱毛模型的建立与评价. 《中国实验动物学报》, XX(X), XXX-XXX. (国内方法学参考)。