百草枯诱导的肺纤维化模型(大鼠) - 中析研究所生物检测中心

百草枯诱导的大鼠肺纤维化模型：检测项目详解

摘要： 百草枯（Paraquat，PQ）诱导的肺纤维化模型是研究肺间质纤维化病理机制及药物干预效果的重要工具。该模型能较好地模拟人类肺纤维化进程中持续的炎症反应、氧化损伤及细胞外基质过度沉积等核心特征。本文重点阐述该模型构建后需进行的关键检测项目，为研究者提供全面的评价体系参考。

一、模型构建简述

常采用成年健康雄性SD或Wistar大鼠，通过一次性腹腔注射百草氯化物溶液（典型剂量范围：20-35 mg/kg体重）建立模型。对照组给予等体积生理盐水。造模后动物饲养于标准环境下，在设定的时间点（通常为给药后7天、14天、21天、28天）进行样本采集与分析。

二、核心检测项目

评估百草枯诱导肺纤维化需采用多维度、多层次的检测策略，以下为关键检测项目：

1. 整体状态与生存分析

* **体重变化：** 定期监测并记录各组大鼠体重变化率。百草枯中毒常导致体重显著下降，是反映系统毒性的敏感指标。 * **生存率：** 记录不同时间点的动物存活数量，计算生存率并绘制生存曲线（Kaplan-Meier曲线）。百草枯的高毒性常伴随较高的死亡率，是评价模型严重程度的重要依据。

2. 肺组织病理学评估（金标准）

* **苏木精-伊红染色：** 评估肺部整体结构破坏、炎症细胞（中性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞）浸润程度、肺泡壁增厚、肺泡腔塌陷与融合、出血等病理变化。可采用半定量评分系统（如Ashcroft评分或其改良版）对纤维化程度进行量化分析。 * **马松三色染色：** **关键指标。** 特异性显示胶原纤维（呈蓝色或绿色），直观展示胶原在肺泡间隔、血管周围及肺间质中的沉积部位与程度。是评价纤维化严重程度最经典、最直观的组织学方法。 * **免疫组织化学/免疫荧光染色：** * **α-平滑肌肌动蛋白：** 标记激活的肌成纤维细胞（Myofibroblast），该细胞是胶原过度合成和沉积的主要效应细胞，其数量增多是纤维化进展的关键标志。 * **转化生长因子-β1：** 检测肺组织中TGF-β1蛋白的表达水平及定位。TGF-β1是驱动纤维化过程的核心细胞因子。 * **其他分子标志物：** 如Vimentin（间质细胞标志）、E-cadherin（上皮细胞标志，上皮-间质转化评估）、CD68（巨噬细胞标志）等，可根据研究目标选择。

3. 肺组织胶原含量定量（关键生化指标）

* **羟脯氨酸含量测定：** **金标准生化指标。** 羟脯氨酸是胶原蛋白特有的氨基酸成分。通过酸水解肺组织，利用比色法（常用氯胺T法或对二甲氨基苯甲醛法）测定肺组织中羟脯氨酸的总含量，直接反映总胶原蛋白的沉积量。结果通常表示为每克肺湿重或干重的羟脯氨酸含量（µg/g）。

4. 炎症与氧化应激指标

* **支气管肺泡灌洗液分析：** * **总细胞计数与分类计数：** 评估炎症细胞（中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞）总数及比例变化，直接反映肺部炎症状态。 * **总蛋白浓度：** 反映肺泡-毛细血管屏障的通透性和损伤程度。 * **炎症因子检测：** 通过ELISA等方法检测BALF中关键促炎因子（如TNF-α， IL-1β， IL-6）和抗炎因子（如IL-10）的水平。 * **肺组织匀浆液氧化应激指标：** * **丙二醛：** 反映脂质过氧化终产物水平，是氧化损伤的重要标志。 * **超氧化物歧化酶/谷胱甘肽过氧化物酶：** 反映机体抗氧化酶活性，通常在氧化应激时消耗增加或活性降低。 * **总抗氧化能力：** 综合评价肺组织的抗氧化储备能力。 * **活性氧簇：** 可使用特异性荧光探针（如DCFH-DA）在组织切片或细胞水平检测ROS水平。

5. 肺功能评估（有条件推荐）

* **无创肺功能仪：** 在动物清醒或轻度麻醉状态下，测定呼吸频率、潮气量、每分通气量等基础参数。纤维化后期可能表现为限制性通气功能障碍（如潮气量降低）。 * **有创肺功能检测（需插管麻醉）：** * **肺顺应性：** 反映肺组织的弹性。肺纤维化导致肺顺应性显著下降（肺变“硬”）。常通过测定压力-容积曲线来计算。 * **肺阻力：** 反映气道通畅度。在部分纤维化模型或合并炎症时可能升高。

6. 分子生物学机制探究

* **实时荧光定量PCR：** 检测肺组织中纤维化相关基因mRNA表达水平，如： * 促纤维化因子：TGF-β1， CTGF (CCN2)， PDGF * 细胞外基质成分：Collagen I (Col1a1)， Collagen III (Col3a1)， Fibronectin (Fn1) * 基质金属蛋白酶及其抑制剂：MMP-2， MMP-9， TIMP-1 * 炎症因子：TNF-α， IL-1β， IL-6 * 氧化应激相关酶：SOD1， SOD2， GPx1 * 纤维化标志物：α-SMA (Acta2) * **Western Blot：** 检测上述关键蛋白在肺组织中的表达水平变化，验证PCR结果并观察蛋白翻译后修饰。

三、结果预期

模型组 vs 对照组：
- 体重下降更显著，生存率降低。
- HE染色可见显著炎症浸润、肺泡结构破坏、间质增厚。
- 马松染色显示大量蓝色胶原纤维增生沉积，纤维化评分显著升高。
- 肺组织羟脯氨酸含量显著增加。
- BALF中炎症细胞总数（尤其中性粒细胞）、总蛋白及促炎因子（TNF-α， IL-1β， IL-6）水平显著升高。
- 肺组织中氧化应激指标（MDA升高， SOD/GPx活性降低或含量减少）显著变化。
- 肺功能显示顺应性下降。
- TGF-β1， α-SMA， Collagen I/III等促纤维化基因和蛋白表达显著上调。

四、讨论要点

百草枯模型能稳定诱导出与人类肺纤维化病理特征相似的变化（炎症、氧化损伤、胶原沉积、结构重塑、功能下降）。
多指标联合评价至关重要： 单一的检测方法不足以全面评估肺纤维化程度。组织病理学（尤其是马松染色和纤维化评分）结合羟脯氨酸含量测定是判断纤维化严重程度的基石。BALF炎症分析和氧化应激指标反映早期驱动因素。肺功能检测提供生理功能终点证据。分子生物学研究深入探讨机制。
检测时间点的选择需根据研究目的确定（如侧重急性炎症期、增生期还是纤维化形成期）。
该模型具有高死亡率、进展相对较快的优点，但也存在个体差异、非肺毒性（如肝肾损伤）等局限性。