DNBS致溃疡性结肠炎（细胞免疫法）(大鼠)

DNBS诱导大鼠溃疡性结肠炎模型：核心检测项目指南

本指南概述了DNBS（2,4-二硝基苯磺酸钠）诱导大鼠溃疡性结肠炎（UC）模型后，评估疾病严重程度、病理变化及免疫反应（尤其细胞免疫）的核心检测项目。研究应遵循相关动物伦理规范。

一、 宏观评估与临床指标

1. 疾病活动指数 (DAI)：

   • 组成： 综合评分体重变化百分比、粪便性状、便血/隐血情况。
   • 方法： 每日观察记录，按标准评分表量化。
   • 意义： 直接反映整体疾病严重程度和进程。

2. 体重变化：

   • 方法： 定期称重，计算相对于初始体重的百分比变化。
   • 意义： UC活动期常见体重下降，是DAI重要组成部分。

3. 摄食与饮水：

   • 方法： 记录每日消耗量。
   • 意义： 间接反映动物健康状况和疾病影响。

二、 解剖学与组织病理学评估

4. 大体形态学评分：

   • 方法： 处死动物后，迅速分离结肠，观察并记录：
     • 结肠长度缩短（炎症标志）。
     • 充血、水肿程度。
     • 粘膜损伤：糜烂、溃疡（数量、大小、深度）、粘连、狭窄、增厚。
     • 是否有可见的粘液或出血。
   • 意义： 直观评估结肠炎症和损伤的宏观表现。

5. 组织病理学评分 (H&E染色)：

   • 方法：
     • 取结肠病变最明显区域及邻近组织，福尔马林固定，石蜡包埋，切片。
     • 苏木精-伊红（H&E）染色。
     • 显微镜下盲法评估（建议采用标准评分系统）：
       • 炎症浸润深度和密度： 粘膜层、粘膜下层、肌层等。
       • 粘膜结构完整性： 隐窝结构破坏（萎缩、分支、消失）、杯状细胞缺失。
       • 溃疡/糜烂范围与深度。
       • 粘膜下层水肿/增厚程度。
   • 意义： 金标准，直接观察微观层面的炎症细胞浸润和组织结构损伤。

三、 炎症标志物检测

6. 髓过氧化物酶活性 (MPO)：

   • 方法： 取结肠组织匀浆，使用特定底物（如四甲基联苯胺，TMB）检测酶活性。
   • 意义： 反映中性粒细胞在结肠组织中浸润的程度，是量化炎症的经典指标。

7. 促炎细胞因子水平：

   • 目标因子： TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-12, IFN-γ (Th1相关), IL-17A (Th17相关), IL-23等。
   • 方法：
     • 组织水平： 结肠组织匀浆后，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）或液相多重蛋白分析（如Luminex）检测。
     • 血清水平 (可选)： ELISA检测血清中细胞因子浓度，反映全身炎症状态。
   • 意义： 量化关键促炎介质的表达，揭示炎症通路激活状态。

8. 抗炎/调节性细胞因子水平：

   • 目标因子： IL-10, TGF-β, IL-4 (Th2相关，在UC中可能变化)。
   • 方法： 同促炎因子检测（组织匀浆ELISA/多重分析）。
   • 意义： 评估内源性抗炎或免疫调节机制的应答。

四、 细胞免疫功能评估 (重点)

9. 免疫细胞亚群分析 (流式细胞术)：

   • 样本来源：
     • 结肠固有层单核细胞 (LPMC)： 关键！需通过酶消化法（如胶原酶、DNA酶）从结肠组织中分离获得，最能代表局部肠道免疫环境。
     • 肠系膜淋巴结细胞 (MLNC)： 引流肠道部位的关键次级淋巴器官。
     • 脾脏细胞 (SPLC)： 反映外周免疫状态。
   • 检测目标细胞群 (需特异性抗体标记)：
     • T细胞亚群：
       • CD4+ T辅助细胞 (Th)： 总CD3+CD4+。
       • Th1细胞： 分泌IFN-γ (需胞内染色) 或表达T-bet (关键转录因子)。
       • Th17细胞： 分泌IL-17A (胞内染色) 或表达RORγt (关键转录因子)。
       • 调节性T细胞 (Treg)： CD4+CD25+Foxp3+ (Foxp3是关键标志物，通常需胞内染色)。 比例(Th17/Treg)常被关注。
       • 细胞毒性T细胞 (CTL)： CD3+CD8+。
     • 其他固有免疫细胞：
       • 巨噬细胞： CD68+或F4/80+，可进一步分型（M1：iNOS+, CD86+; M2：CD206+, Arg1+）。(需胞内染色或表面标记组合)
       • 树突状细胞 (DC)： CD11c+，可细分亚群（如CD103+ cDC1, CD11b+ cDC2）。(常结合MHC II等标记)
       • 中性粒细胞： CD11b+Ly6G+ (常为Ly6Ghi)。
       • 自然杀伤细胞 (NK)： CD3-NK1.1+ (大鼠) 或 CD3-CD161a+ (NKR-P1A)。
   • 意义： 定量分析结肠局部及引流淋巴结/外周免疫器官中关键效应性和调节性免疫细胞的比例和数量变化，是理解UC细胞免疫失衡的核心手段。

10. T细胞功能性分析 (体外刺激)：

    • 方法： 分离LPMC、MLNC或SPLC，体外用细胞刺激剂（如PMA + 离子霉素）或抗原特异性刺激（如适用），同时加入蛋白质运输抑制剂（如Brefeldin A/Monensin）。
    • 检测： 流式细胞术胞内染色检测细胞因子产生（IFN-γ, IL-17A, IL-4, IL-10等）。
    • 意义： 评估不同T细胞亚群（Th1, Th17, Th2, Treg）的功能活性（细胞因子分泌能力）。

11. 免疫组织化学 (IHC) 或 免疫荧光 (IF)：

    • 目标： 在结肠组织切片上可视化特定免疫细胞的浸润和定位。
    • 常用标记物：
      • CD3： 泛T细胞标记。
      • CD4： 辅助T细胞。
      • CD8： 细胞毒性T细胞。
      • Foxp3： 调节性T细胞。
      • CD68 / F4/80 / Iba1： 巨噬细胞。
      • MPO： 中性粒细胞。
      • IL-17A, IFN-γ： 效应T细胞产生的细胞因子。
    • 意义： 提供免疫细胞在结肠组织内空间分布和浸润模式的关键信息，与H&E病理评分互补。

五、 肠道屏障功能评估 (可选，重要关联指标)

12. 紧密连接蛋白表达：

    • 目标蛋白： Occludin, Claudins (如Claudin-1, -2, -3, -4, -5), Zonula Occludens-1 (ZO-1)。
    • 方法：
      • 免疫印迹 (Western Blot)： 检测结肠组织匀浆中蛋白表达量。
      • 免疫组化/免疫荧光： 观察蛋白在肠上皮细胞间的定位和连续性是否破坏。
    • 意义： 评估肠上皮物理屏障完整性的关键标志。

13. 血清/粪便生物标志物 (可选)：

    • 脂多糖结合蛋白 (LBP) 或 内毒素： 反映肠道通透性增加和细菌易位程度。
    • 粪便钙卫蛋白： 反映肠道中性粒细胞浸润（与MPO相关）。
    • 方法： ELISA检测血清（LBP，内毒素）或粪便提取物（钙卫蛋白）。

研究设计关键点提示：

• 对照组设置： 必须包含健康对照组（仅接受载体溶液）和模型对照组（接受DNBS）。
• 取材时间点： 根据研究目的（急性期/恢复期效应）选择合适时间点处死取材（如诱导后3、5、7天是急性期常用点）。
• 结肠分段处理： 明确注明取材部位（远端结肠最常受累），可分段取材分析。
• 样本处理： 新鲜组织取材后，部分立即用于酶活性检测或细胞分离（LPMC），部分速冻于液氮后-80℃保存（用于WB、ELISA、RNA），部分福尔马林固定（用于病理和IHC/IF）。
• 技术重复与生物学重复： 确保实验结果的可靠性和统计效力。
• 伦理审查： 实验方案需经动物实验伦理委员会批准。

总结：

全面评估DNBS诱导的大鼠UC模型，需结合宏观临床评分（DAI、体重）、解剖学观察（大体评分、结肠长度）、金标准组织病理学（H&E评分）、炎症标志物（MPO、细胞因子） 以及核心的细胞免疫功能分析（流式细胞术分析LPMC/MLNC中T细胞亚群、巨噬细胞等；IHC/IF定位；必要时体外功能实验）。肠道屏障功能相关检测能够提供疾病机制的更深层次理解。研究者应根据具体科学问题和实验室条件，选择最合适的组合检测项目。