TNBS致溃疡性结肠炎（细胞免疫法）(大鼠)

发布时间：2025-06-10 08:19:14 阅读量：6 作者：生物检测中心

TNBS诱导大鼠溃疡性结肠炎模型的细胞免疫学检测项目详解

模型简述： 三硝基苯磺酸（TNBS）与乙醇联合诱导的大鼠溃疡性结肠炎（UC）模型是研究人类UC发病机制及免疫调节治疗的经典工具。该模型模拟了人类UC的Th1/Th17型免疫反应亢进及调节性T细胞（Treg）功能受损等核心免疫特征。深入剖析模型中的细胞免疫状态是研究的关键环节。

核心细胞免疫学检测项目：

一、 免疫细胞亚群分析（流式细胞术为核心）

  1. T淋巴细胞亚群：
    • CD4⁺ T细胞 (Helper T cells)： 总量及比例，是免疫反应的核心驱动者。
    • CD8⁺ T细胞 (Cytotoxic T cells)： 总量及比例，评估细胞毒性反应。
    • Th1细胞： 关键效应细胞（分泌IFN-γ）。通常通过检测 CD4⁺IFN-γ⁺ 细胞比例，或结合转录因子 T-bet 表达分析。
    • Th17细胞： 关键效应细胞（分泌IL-17A/F）。核心检测为 CD4⁺IL-17A⁺ 细胞比例，可辅以 RORγt 转录因子检测。
    • 调节性T细胞 (Treg)： 关键抑制性细胞（分泌IL-10，表达Foxp3）。核心检测为 CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺ 细胞比例（需胞内染色）。其功能状态至关重要。
    • Th2细胞： 在大鼠TNBS模型中通常不是主导，但可检测 CD4⁺IL-4⁺ 细胞比例或 GATA3 表达作为参考。
    • γδ T细胞： 肠道固有层重要免疫细胞，可检测其比例（如 TCRγδ⁺）及活化状态。
  2. 髓系细胞：
    • 巨噬细胞： 检测 CD68⁺ 或 CD11b/c⁺ 细胞比例。重点区分 促炎型 (M1，常高表达iNOS, CD86) 和 抗炎/修复型 (M2，常高表达CD206, Arg1) 极化状态（需胞内/表面标记组合）。
    • 树突状细胞 (DC)： 检测 CD11c⁺ 细胞比例及亚群（如CD103⁺ DC），关注其成熟/活化标记（如MHC-II, CD80, CD86）。
    • 中性粒细胞： 检测 CD11b⁺Ly6G⁺ 细胞比例，反映急性炎症浸润程度。
  3. 固有淋巴细胞 (ILCs)： 特别是ILC3（与Th17功能类似，分泌IL-17/IL-22），可通过特定表面标记组合（如大鼠中的Lineage⁻ CD127⁺ RORγt⁺）进行鉴定（技术难度较高）。

二、 细胞因子与炎症介质检测

  1. 关键效应细胞因子：
    • Th1相关： IFN-γ, TNF-α
    • Th17相关： IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22
    • 促炎介质： IL-1β, IL-6, IL-12/IL-23p40 (共用亚基), CXCL1/KC (中性粒细胞趋化因子)
  2. 调节性/抗炎细胞因子：
    • Treg相关： IL-10, TGF-β
    • Th2相关： IL-4, IL-5, IL-13 (在TNBS模型中水平通常较低)
    • 其他： IL-37 (抗炎)
  3. 检测方法：
    • 酶联免疫吸附试验 (ELISA/ELISPOT)： 定量检测结肠组织匀浆液、血清或培养上清中特定细胞因子蛋白水平。ELISPOT可检测分泌特定细胞因子的细胞频率（如IFN-γ⁺或IL-17A⁺细胞）。
    • 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)： 检测结肠组织或分离细胞中上述细胞因子及关键转录因子（T-bet, RORγt, Foxp3, GATA3）的mRNA表达水平。反映基因转录活性。
    • 流式细胞术胞内因子染色 (ICS)： 结合细胞表面标记，直接在单细胞水平鉴定产生特定细胞因子（如IFN-γ, IL-17A, IL-10）的免疫细胞亚群（如Th1, Th17, Treg）。

三、 组织病理学与免疫组化/荧光

  1. 常规组织病理学评分 (H&E染色)：
    • 炎症细胞浸润深度与密度: 评价固有层、粘膜下层等部位中性粒细胞、淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等的浸润程度。
    • 隐窝结构破坏： 隐窝扭曲、分支、萎缩、消失。
    • 杯状细胞减少： 黏液分泌耗竭。
    • 溃疡/糜烂形成： 粘膜上皮缺损范围。
    • （提供具体评分标准，如0-4分制）
  2. 免疫组织化学 (IHC) / 免疫荧光 (IF)：
    • 定位与丰度分析： 在结肠组织切片上直观显示特定免疫细胞在病变部位的浸润定位（如粘膜层、粘膜下层）和相对丰度。
      • 常用标记物： CD3 (总T细胞), CD4 (辅助T), CD8 (细胞毒T), CD68/CD163 (巨噬细胞), MPO (中性粒细胞髓过氧化物酶), Foxp3 (Treg), IL-17A, IFN-γ 等。
    • 细胞活化/增殖状态： 如 Ki-67 (增殖细胞核抗原)。
    • 细胞死亡检测： TUNEL法检测细胞凋亡。

关键样本来源：

  1. 结肠组织： 核心样本。用于组织病理学、IHC/IF、qRT-PCR、组织匀浆ELISA、酶活性测定等。需迅速分装处理（固定、液氮速冻、匀浆等）。
  2. 肠系膜淋巴结 (MLN)： 肠道引流淋巴结，是肠道免疫反应启动和扩增的关键部位。主要用于流式细胞术分析免疫细胞亚群、离体刺激后胞内因子染色、淋巴细胞增殖实验等。
  3. 脾脏： 反映系统性免疫状态。用途同MLN。
  4. 外周血： 反映系统性免疫状态（如血清细胞因子水平、循环免疫细胞亚群）。需注意抗凝处理。

检测时间点选择：

  • 急性期： 通常在TNBS诱导后3-7天。炎症高峰，Th1/Th17反应强烈，适合研究急性炎症机制和药物干预的即时效应。
  • 慢性/恢复期： 诱导后10-14天或更长。炎症持续或进入恢复阶段，适合研究慢性化机制、组织修复和免疫调节过程（如Treg功能）。

总结： 全面评估TNBS诱导的大鼠溃疡性结肠炎模型的细胞免疫状态，需要结合 免疫细胞亚群精细分型（流式）、关键细胞因子/转录因子表达水平检测（ELISA, qPCR, ICS） 以及 组织病理学与免疫组化定位分析 三大支柱技术。选择 结肠组织、肠系膜淋巴结、脾脏 等关键组织器官，并在合适的疾病阶段（急性期/慢性期）进行采样分析，才能深入解析肠道免疫失衡的本质及其在UC发病中的作用，为后续的药物疗效评价或机制研究提供坚实的免疫学基础。所有项目设计应严格遵守实验动物伦理和操作规范。