坐骨神经分枝选择性损伤模型（SNI）(小鼠/大鼠)

坐骨神经分枝选择性损伤模型（SNI）研究指南：核心检测项目

核心检测项目：

检测项目的选择应围绕评估神经损伤后的感觉功能异常（疼痛行为学）、运动功能变化、神经损伤与再生状态以及潜在的分子和细胞机制。

一、 疼痛行为学评估 (核心重点)

这是SNI模型成功建立和评估干预效果的最直接、最重要的指标。需在安静、恒温环境下进行，测试前让动物充分适应环境。操作者需盲法进行测试和记录。

1. 机械性触诱发痛 (Mechanical Allodynia):

   • 检测原理： 评估非伤害性机械刺激（如轻柔触摸、刷毛）引发的疼痛反应（缩爪、舔爪、躲避）。
   • 主要方法：
     • Von Frey 细丝测试 (Up-Down Method): 最常用。使用一系列不同力度（常用单位：克力, g）的尼龙单丝，垂直刺激足底（避开足垫）或腓浅神经支配区域（如足背外侧）。记录引起缩爪反应的最小力度（50% 机械缩足阈值, PWT）。
     • 动态触诱发痛 (Brush Test): 用软毛刷（如化妆刷）轻柔、匀速刷过足底或腓浅神经支配区皮肤，观察并记录动物出现躲避、缩爪、舔爪等疼痛行为的次数或持续时间。
   • 结果解读： SNI术后，损伤侧肢体的PWT显著降低（阈值下降），或对刷毛刺激的反应显著增加，表明出现机械性触诱发痛。通常在术后几天内出现，持续数周至数月。

2. 机械性痛觉过敏 (Mechanical Hyperalgesia):

   • 检测原理： 评估对伤害性机械刺激（如针刺）的敏感性增加。
   • 主要方法：
     • 针刺测试 (Pinprick Test): 使用钝头针（如注射器针头磨钝）或专用针器，以刚好不刺破皮肤的力度刺激足底或腓浅神经支配区皮肤。记录缩爪潜伏期（刺激开始到缩爪的时间）或反应强度（评分）。
   • 结果解读： SNI术后，损伤侧肢体对针刺刺激的反应潜伏期缩短或反应强度增加，表明出现机械性痛觉过敏。

3. 热痛觉过敏 (Thermal Hyperalgesia):

   • 检测原理： 评估对伤害性热刺激（如辐射热）的敏感性增加。
   • 主要方法：
     • Hargreaves 测试 (Plantar Test): 动物置于玻璃平板上，下方有可移动的聚焦热光源照射足底（避开足垫）。仪器自动记录从热刺激开始到动物缩爪的潜伏期。
   • 结果解读： SNI术后，损伤侧肢体缩爪潜伏期显著缩短，表明出现热痛觉过敏。通常在术后几天内出现。

4. 冷触诱发痛/痛觉过敏 (Cold Allodynia/Hyperalgesia):

   • 检测原理： 评估非伤害性或轻度伤害性冷刺激引发的疼痛反应。
   • 主要方法：
     • 丙酮/乙醇蒸发测试： 用微量移液器将一小滴（如50-100μl）丙酮或乙醇（室温）滴在足底或腓浅神经支配区皮肤。记录动物出现舔爪、缩爪、抬腿等行为的次数或持续时间（通常观察30-60秒）。
     • 冷板测试 (Cold Plate Test)： 将动物置于设定在低温（如4°C）的金属板上，记录一定时间内（如2-5分钟）动物出现抬足、舔足或跳跃行为的次数或累计时间。
     • 冷探针测试 (Cold Probe Test)： 用预冷的金属探针（如0-4°C）接触足底皮肤，记录缩爪潜伏期或反应评分。
   • 结果解读： SNI术后，损伤侧肢体对冷刺激的反应显著增加（如舔爪次数增多、抬足时间延长、潜伏期缩短），表明出现冷敏异常（可能是触诱发痛或痛觉过敏）。

5. 自发性疼痛/不适 (Spontaneous Pain/Guarding)：

   • 检测原理： 评估动物在无外界刺激时表现出的疼痛相关行为。
   • 主要方法：
     • 姿势评分 (Guarding Score)： 观察动物在笼内自由活动或置于透明观察盒中时的后肢姿势。通常采用评分系统（如0分：足底完全着地承重；1分：足底轻触地面但不承重；2分：足底完全抬离地面）。
     • 自发舔爪/抬腿行为计数： 在特定观察期内（如5-10分钟），记录动物舔舐或啃咬损伤侧后肢（尤其是足部）的次数，或抬腿不承重的持续时间。
   • 结果解读： SNI术后，损伤侧肢体姿势评分升高，舔爪/抬腿行为增多，提示存在自发性疼痛或不适。

二、 运动功能评估

评估SNI手术本身或干预措施是否影响运动能力。

1. 步态分析 (Gait Analysis):

   • 检测原理： 量化行走时步态参数的变化。
   • 主要方法：
     • 足迹分析 (Ink Footprint Test)： 动物足底涂上墨水，走过白纸通道。测量步长（stride length）、步宽（stride width）、足印重叠度等。可计算坐骨神经功能指数（Sciatic Functional Index, SFI）。
     • 自动步态分析系统 (CatWalk, DigiGait)： 更精确、客观，可分析大量步态参数（各爪接触面积、压力、摆动期/支撑期时间、协调性等）。
   • 结果解读： SNI主要损伤感觉神经（腓总神经包含运动纤维），可能导致轻微步态异常（如足下垂、步态不稳）。需注意与疼痛导致的保护性步态区分。干预措施不应引起过度运动障碍。

2. 平衡与协调能力测试：

   • 旋转棒测试 (Rotarod Test)： 评估运动协调、平衡和耐力。动物在旋转的棒上行走，记录跌落前的停留时间或转速。
   • 平衡木测试 (Beam Walking Test)： 评估精细运动协调和平衡能力。记录动物通过窄木条的时间、滑落次数等。
   • 结果解读： SNI本身对平衡协调影响通常较小。这些测试主要用于排除药物或干预措施对运动系统的非特异性毒性或抑制作用。

三、 神经损伤与再生评估

1. 神经形态学与组织学：

   • 取材： 术后特定时间点（如术后7, 14, 21, 28天），取损伤区近端残端、损伤区、远端神经（腓浅神经、胫神经残端）、背根神经节（DRG, L4-L6）、脊髓（腰膨大）。
   • 主要方法：
     • 大体观察： 观察神经残端有无神经瘤形成。
     • 石蜡/冰冻切片： H&E染色观察神经结构、炎症细胞浸润；甲苯胺蓝染色观察髓鞘；免疫组织化学/免疫荧光染色检测：
       • 轴突标记物： βIII-Tubulin, NF200 (标记大髓鞘纤维), Peripherin (标记小纤维)。
       • 髓鞘标记物： MBP, P0。
       • 施万细胞标记物： S100, GFAP。
       • 巨噬细胞/小胶质细胞标记物： Iba1, CD68 (外周神经), Iba1, CD11b (脊髓)。
       • 星形胶质细胞标记物： GFAP (脊髓)。
       • 神经损伤/再生标记物： ATF3 (DRG神经元、施万细胞), GAP43 (再生轴突生长锥)。
     • 电镜： 观察轴突、髓鞘超微结构变化，精确计数有髓/无髓轴突数量。
   • 结果解读： 评估损伤程度、瓦勒氏变性进程、炎症反应（巨噬细胞浸润）、胶质细胞活化（脊髓小胶质细胞、星形胶质细胞）、施万细胞去分化/增殖、轴突再生尝试（向神经瘤内生长，而非有效长入远端腓浅神经）。

2. 神经电生理 (可选)：

   • 检测原理： 评估神经传导功能。
   • 主要方法： 刺激坐骨神经近端，在腓浅神经（损伤区远端）或足部肌肉记录复合动作电位（CAP）或肌电图（EMG）。测量传导速度、振幅。
   • 结果解读： SNI后，受损神经（腓总神经、腓肠神经）传导功能丧失。腓浅神经传导功能理论上应正常（模型核心），但实际操作或继发炎症可能影响。主要用于特定研究（如再生效果评估）。

四、 分子生物学检测

探索疼痛及神经损伤修复的分子机制。

1. 基因表达分析：
   • 取材： 背根神经节（DRG, L4-L6）、脊髓（腰膨大）、损伤局部神经组织、甚至外周血或特定脑区。
   • 主要方法：
     • 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)： 检测特定基因mRNA表达水平。
     • 蛋白质印迹 (Western Blot)： 检测特定蛋白表达水平及翻译后修饰（如磷酸化）。
     • 酶联免疫吸附试验 (ELISA)： 定量检测组织匀浆上清或血清/脑脊液中的细胞因子、趋化因子等可溶性因子浓度。
   • 关键靶标举例：
     • 炎症因子： TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10。
     • 趋化因子： CCL2 (MCP-1), CX3CL1 (Fractalkine), CXCL1。
     • 疼痛相关离子通道/受体： TRPV1 (热痛), TRPA1 (冷痛、机械痛), Nav1.3, Nav1.7, Nav1.8 (钠通道), Cav3.2 (T型钙通道), P2X3, P2X4 (嘌呤受体)。
     • 神经递质/调质： 物质P (SP), 降钙素基因相关肽 (CGRP), BDNF (脊髓小胶质细胞来源)。
     • 胶质细胞活化标记： GFAP (星形胶质细胞), Iba1, CD11b (小胶质细胞)。
     • 信号通路分子： p38 MAPK, ERK, JNK, NF-κB (炎症、疼痛信号传导)。
     • 神经损伤/修复相关分子： ATF3, GAP43, p75NTR, NGF, GDNF。

五、 其他可选检测

1. 药理学验证： 使用已知的镇痛药（如加巴喷丁、普瑞巴林、吗啡）验证模型疼痛行为的药理学反应性。
2. 条件位置偏爱/厌恶 (CPP/CPA)： 评估自发痛的动机成分（难度较大）。
3. 微透析/在体电生理： 在体监测脊髓或特定脑区神经递质释放或神经元电活动（技术要求高）。

实验设计关键注意事项：

• 对照组： 必须设立假手术组（暴露神经但不损伤）和/或未手术对照组。同笼饲养。
• 随机化与盲法： 动物分组、手术、行为学测试、结果分析均需随机化和盲法操作，最大限度减少偏差。
• 基线测试： 手术前进行所有行为学测试，建立个体基线值。
• 术后测试时间窗： 根据研究目的选择合适的时间点（如术后3, 7, 10, 14, 21, 28天）。行为学通常在术后1周内开始出现明显变化。
• 动物福利与伦理： 严格遵守动物实验伦理规范，提供充足镇痛（术后急性期）、环境富集，密切观察动物状态。设定明确的人道终点。
• 性别考虑： 明确实验使用动物的性别（雄性或雌性），或比较性别差异，因疼痛机制可能存在性别二态性。
• 环境控制： 保持测试环境（温度、湿度、光照、噪音）恒定，测试时间相对固定（考虑昼夜节律）。

总结：

SNI模型是研究神经病理性疼痛机制的强大工具。疼痛行为学检测（尤其是机械性触诱发痛和热痛觉过敏）是评估模型成功和干预效果的核心。 结合神经形态学、分子生物学和（可选）电生理学检测，可以全面解析SNI诱导的神经损伤、炎症反应、感觉神经元敏化、脊髓中枢敏化以及潜在的修复/再生过程。严谨的实验设计、规范的动物操作和细致的检测是获得可靠、可重复研究结果的关键。