LPS诱导的热痛觉过敏模型(小鼠/大鼠)

LPS诱导热痛觉过敏模型：核心检测项目详解

一、 核心行为学检测：热痛觉过敏的确认（首要目标）

1. 辐射热法（Hargreaves Test）：

   • 原理： 将聚焦光束照射于动物（通常是大鼠或小鼠）后足掌心，记录从刺激开始到动物出现抬足、舔舐或缩足等逃避反射的潜伏期（秒）。
   • 检测目的： 直接评估动物对热刺激的敏感性变化。 LPS诱导成功时，逃避潜伏期会显著缩短，表明热痛阈降低，即发生热痛觉过敏。
   • 关键点： 实验前需进行基线测定，LPS注射后在不同时间点（如2h、4h、6h、24h等）重复测定，绘制时间-效应曲线。

2. 热板法（Hot Plate Test）：

   • 原理： 将动物置于设定温度（通常50-55°C）的金属板上，记录动物出现舔后足、跳跃等疼痛反应的时间（潜伏期，秒）。
   • 检测目的： 评估动物对非伤害性热板产生的脊髓上整合性痛反应（主要反映脊髓以上中枢敏化）。
   • 检测目的： LPS诱导成功后，潜伏期会显著缩短。
   • 关键点： 适用于小鼠；需注意设定截止时间防止组织损伤；反映的痛觉整合通路与辐射热法略有不同。

二、 炎症评估：模型建立的病理基础

1. 局部炎症指标（尤其适用于足底注射模型）：

   • 足趾/足掌肿胀度：
     • 方法： 使用游标卡尺或无创体积测量仪测量注射部位（足趾/足掌）厚度或体积。
     • 检测目的： 量化局部炎症反应的水肿程度。LPS注射后肿胀度会显著增加。
   • 局部组织炎症因子水平：
     • 方法： 在特定时间点（如行为学检测后）处死动物，取注射部位足底软组织或脊髓/背根神经节。
     • 检测技术： ELISA、Luminex、Western Blot（蛋白水平）；RT-qPCR（mRNA水平）。
     • 关键指标：
       • 促炎细胞因子： IL-1β, TNF-α, IL-6（驱动炎症和痛觉敏化的核心因子）。
       • 趋化因子： MCP-1/CCL2（招募免疫细胞）。
       • 炎症介质： COX-2, PGE2（介导热痛觉过敏的关键通路）。
       • 其他： NGF, BDNF（参与神经元敏化）。
     • 检测目的： 证实LPS注射成功引发了局部炎症因子风暴，是痛觉过敏的分子基础。

2. 系统性炎症指标（适用于全身模型或评估全身影响）：

   • 血清/血浆炎症因子水平：
     • 方法： 采集血液，分离血清/血浆。
     • 检测技术： ELISA、Luminex。
     • 关键指标： IL-1β, TNF-α, IL-6。
     • 检测目的： 评估LPS引起的系统性炎症反应水平。
   • 免疫细胞浸润分析：
     • 方法： 取外周血、注射部位组织或脊髓/背根神经节，制备单细胞悬液。
     • 检测技术： 流式细胞术（FACS）。
     • 关键指标： 中性粒细胞、巨噬细胞（M1/M2表型）、T细胞等免疫细胞的数目和比例变化。
     • 检测目的： 揭示参与炎症和痛觉敏化的关键免疫细胞类型及其活化状态。

三、 痛觉敏化通路关键分子检测

1. 外周敏化相关：

   • 背根神经节神经元兴奋性变化：
     • 方法： 体外电生理记录（膜片钳）。
     • 检测目的： 观察LPS刺激后，伤害性感觉神经元（如小直径C纤维神经元）的自发放电频率是否增加，对刺激的反应性是否增强（兴奋性增高）。
   • 背根神经节炎症/敏化因子表达：
     • 方法： 取DRGs组织。
     • 检测技术： RT-qPCR, Western Blot, 免疫组化/荧光。
     • 关键指标： TRPV1（热痛敏关键通道）、Nav1.7/1.8（电压门控钠通道）、前述炎症因子（如COX-2, PGE2受体）、pERK（活化标志）等。
     • 检测目的： 揭示外周感觉神经元敏化的分子机制。

2. 中枢敏化相关（脊髓水平）：

   • 脊髓背角神经元活性标志物：
     • 方法： 取腰膨大（L4-L6）脊髓背角组织。
     • 检测技术： Western Blot, 免疫组化/荧光。
     • 关键指标：
       • 即刻早期基因： c-Fos（神经元活化的经典标志）。
       • 信号通路分子： pERK, pCREB, p-p38 MAPK（参与痛信号传递和敏化）。
       • 神经递质/调质： 谷氨酸受体（如GluA1的磷酸化）、甘氨酸受体、SP, CGRP等。
     • 检测目的： 评估脊髓背角二级感觉神经元和中间神经元的兴奋性状态。
   • 脊髓胶质细胞活化：
     • 方法： 取脊髓组织。
     • 检测技术： RT-qPCR, Western Blot, 免疫组化/荧光。
     • 关键指标：
       • 星形胶质细胞： GFAP（形态标志）, Connexin-43（缝隙连接蛋白）。
       • 小胶质细胞： Iba1（形态标志）, CD11b, CD68（活化标志）；炎症因子（TNF-α, IL-1β, IL-6）及BDNF。
     • 检测目的： 胶质细胞（尤其小胶质细胞）活化是LPS诱导中枢敏化的核心环节，释放大量炎症因子和神经活性物质（如BDNF）促进痛觉过敏。
   • 脊髓炎症因子及介质： 检测炎症因子（IL-1β, TNF-α, IL-6）、趋化因子（CCL2）和关键介质（COX-2, PGE2）在脊髓背角的表达水平，方法与局部组织检测相同。

四、 可选补充检测

• 机械痛觉过敏（Von Frey Filaments）： 虽然模型重点在热痛，但LPS也可能引起机械痛敏，可用此方法评估。
• 自发痛行为观察： 如抬足、舔舐/啃咬注射足等，作为辅助评估。
• 脊髓背角基因表达谱分析： 如RNA-seq，用于探索新的机制靶点。

总结：

LPS诱导热痛觉过敏模型的检测核心是行为学验证（辐射热法/热板法），这是模型成功的直接证据。在此基础上，深入检测局部和系统性炎症水平（重点是促炎因子）、外周神经元敏化（DRG兴奋性及分子表达） 以及中枢敏化（脊髓神经元活性、胶质细胞活化及相关通路分子） 是阐明模型机制的关键。通过这一系列多层次的检测，能够全面评估模型的建立效果并深入探究LPS诱发炎症性热痛觉过敏的病理生理机制。在研究设计中，应根据具体科学问题和实验条件选择最关键的组合检测项目。