明暗穿梭实验方案（小鼠）
1. 实验目的： 评估小鼠的自发性焦虑样行为。利用啮齿类动物天生偏好黑暗封闭环境（趋暗性）又存在探索新环境（明区）动机的矛盾特性，通过测量其在新奇明暗箱环境中的行为模式来反映焦虑水平。
2. 实验动物：
- 物种： 小鼠 (Mus musculus)
- 品系： [请在此处填写所使用的特定品系，如C57BL/6]
- 数量与分组： 实验组与对照组动物数量，明确每组n值。
- 状态： 年龄、性别、饲养条件（温度、湿度、光照周期）、实验前健康状况需详细说明。
- 适应性： 实验前动物应在行为测试实验室适应环境至少1小时。
3. 实验装置：
- 明暗穿梭箱： 由一个矩形箱体构成，内部被分隔成两个大小不等的连通隔室。
- 明箱区： 较大的隔室（通常占总面积2/3），箱壁透明，顶部开放或由透明材料覆盖，底部铺设透明地板支架动物。实验时由高强度白光均匀照明（通常300-500 lux）。
- 暗箱区： 较小的隔室（通常占总面积1/3），箱壁和顶部不透明（通常黑色），底部铺设不透明地板支架动物。实验时光线极暗（通常<5 lux）。
- 连接通道： 两区之间底部中央位置设有一个大小仅容单只小鼠通过的方形或拱形门洞（例如 5cm x 5cm），允许小鼠在两区之间自由穿梭。
- 摄像监控系统： 在箱体正上方或侧上方固定高清摄像头，确保视野完整覆盖明箱、暗箱及连接门洞区域。
- 照明系统： 明箱区需配备可调控的稳定白光光源。
- 分析软件： 使用专业动物行为分析软件，能够实时或后期追踪动物位置、运动轨迹、区分明暗区域并自动计算相关行为参数。
4. 实验流程：
- 准备：
- 彻底清洁穿梭箱各区域（明箱、暗箱、门洞）及支架，使用适当消毒剂清除气味残留，确保箱体干燥。
- 设定明箱区光照强度至标准亮度（如400 lux），确认暗箱区符合低光要求。
- 启动并调试摄像监控系统及行为分析软件，确保视野清晰、区域划分准确（明区、暗区、门洞）、时间记录精确。
- 实验环境保持安静、温度适宜、尽量减少外界干扰。
- 动物引入：
- 轻柔抓取小鼠，将其面朝远离门洞的方向放置在明箱区的中心位置。
- 立即启动摄像记录和软件计时。
- 行为测试：
- 允许小鼠在明暗穿梭箱内自由探索5分钟。
- 期间实验人员离开测试房间或在隐蔽处观测，避免干扰动物行为。
- 结束：
- 测试时间（5分钟）结束时，停止录像和软件记录。
- 轻柔将小鼠移出穿梭箱，放回饲养笼。
- 彻底清洁穿梭箱，准备下一只小鼠测试。不同组别/不同处理的小鼠测试顺序应随机化。
5. 核心检测项目（软件自动分析）： 软件基于持续的视频流，通过识别动物轮廓、重心或特定身体标记点（如鼻尖、重心），实时追踪小鼠在明暗两区的空间位置和运动轨迹，并自动计算以下核心指标：
- 进入暗区潜伏期：
- 定义： 小鼠从被放入明箱开始，到第一次全身（所有四爪和尾部）完全进入暗箱区所经历的时间（秒）。
- 意义： 反映小鼠初始进入安全区域（暗箱）的动机强度或对明箱新环境的犹豫程度。潜伏期延长常被认为焦虑水平升高。
- 明区停留时间：
- 定义： 小鼠在明箱区域内停留的总时间（秒）及其占总测试时间（300秒）的百分比（%）。
- 意义： 直接反映小鼠在“厌恶”（明亮开放）环境中停留的意愿。时间越短、百分比越低，通常提示焦虑水平越高。
- 暗区停留时间：
- 定义： 小鼠在暗箱区域内停留的总时间（秒）及其占总测试时间（300秒）的百分比（%）。
- 意义： 与明区停留时间互补。
- 穿梭次数：
- 定义： 小鼠完全穿越连接门洞（全身从一区移动到另一区）的总次数。软件需准确定义“完全穿越”判定标准（如重心点通过门洞中心线）。
- 意义： 反映小鼠在明暗两区之间的活动性和探索意愿。穿梭次数减少可能反映活动抑制或焦虑升高。
- 穿梭次数比例：
- 定义： 小鼠从明区向暗区的穿梭次数 / 从暗区向明区的穿梭次数。
- 意义： 比值大于1（倾向躲回暗区）可能提示更高的焦虑水平。
- 运动活性（可选但推荐）：
- 定义： 总移动距离（厘米）和/或平均移动速度（厘米/秒），通常在整个穿梭箱内计算。
- 意义： 评估整体活动水平，有助于区分焦虑相关的行为抑制与单纯的活力低下。结合前几项指标解读更准确。
- 探索行为指标（进阶）：
- 定义： 在明区内的移动距离、速度、轨迹复杂度（如熵值）等。
- 意义： 更精细地评估小鼠在明区（潜在威胁环境）中的探索意愿和模式。
- 门洞探索行为（进阶）：
- 定义： 头部伸入门洞但未完全进入另一区的次数和时长。
- 意义： 反映小鼠的风险评估行为（Risk Assessment Behavior）。
- 每次穿梭持续时间（进阶）：
- 定义： 分析每次穿梭所需时间。
- 意义： 可能反映犹豫程度。
- 行为模式时序图：
- 定义： 软件生成动物在明、暗、门洞区域随时间变化的轨迹图或位置热图。
- 意义： 直观展示动物行为随时间的变化模式和在空间中的偏好分布。
6. 数据分析：
- 软件自动计算每只小鼠的所有检测参数。
- 数据导出后，进行组间统计学分析（如t检验， ANOVA等），比较核心指标（潜伏期、明区停留时间/百分比、穿梭次数）的差异显著性。
- 结合运动活性结果，解读焦虑样行为差异是否由活动性差异引起。
- 可视化呈现（如柱状图、箱线图、轨迹图、热图）。
7. 关键注意事项：
- 环境控制： 光照强度、背景噪音、气味、温度、湿度必须严格标准化且保持一致。
- 装置清洁： 每只小鼠测试后必须彻底清洁穿梭箱，消除气味线索，防止残留信息影响后续动物行为。
- 实验者影响： 测试过程中实验人员应隐蔽或离开测试室，避免干扰。
- 时间一致性： 所有测试应在一天中的相同时间段进行（通常在动物活跃期）。
- 软件校准： 每次实验前必须验证软件对明区、暗区和门洞的区域划分是否准确，并进行必要的校准。
- 视频标记： 确保视频文件清晰记录每个实验的动物编号、日期、时间等信息，并与软件输出数据正确对应。
- 伦理声明： 实验方案需经实验动物伦理委员会批准，遵循“3R”原则（替代、减少、优化），最大限度减少动物痛苦。
8. 结果解读：
- 焦虑水平升高（Anxiogenic-like effect）的表现：
- 显著延长首次进入暗区的潜伏期。
- 显著减少在明区停留的总时间和百分比。
- 显著增加在暗区停留的总时间和百分比。
- 显著减少总的穿梭次数（特别是从暗区到明区的穿梭）。
- （可能伴随）明区活动距离/速度降低。
- 焦虑水平降低（Anxiolytic-like effect）的表现：
- 显著缩短首次进入暗区的潜伏期。
- 显著增加在明区停留的总时间和百分比。
- 显著减少在暗区停留的总时间和百分比。
- 显著增加总的穿梭次数（特别是从暗区到明区的穿梭）。
- （可能伴随）明区活动距离/速度增加。
9. 讨论： 明暗穿梭实验是评估小鼠焦虑样行为简便、快速且广泛应用的经典范式。通过全程摄像监控和专业软件分析，能够客观、量化地捕捉动物在冲突情境下的行为选择。核心指标（潜伏期、明区停留时间、穿梭次数）的组合分析为焦虑状态提供了有效评估。需注意，该实验主要反映自发性焦虑，其结果可能受到动物品系、性别、年龄、测试前经历及整体活动水平的影响，因此结合其他行为学测试（如旷场实验、高架十字迷宫）和生理生化指标进行综合判断更为严谨。软件的自动化分析大大提高了通量和客观性，但前期参数设置和验证至关重要。