旷场实验（OF）：基于视频分析的动物行为评估标准方案
一、 实验目的 旷场实验（Open Field Test, OFT）是利用动物对新开阔环境的探索与恐惧矛盾心理，量化评估实验动物（小鼠/大鼠）自发活动性、探索行为、焦虑样状态及非特异性应激反应的核心行为学范式。广泛应用于神经科学、精神药理学、遗传学及毒理学等领域。
二、 实验设备与环境
- 旷场装置：
- 材质：非反射材料（如哑光塑料、涂漆木板），通常为方形或圆形。
- 尺寸：
- 小鼠：典型尺寸为40cm x 40cm x 40cm (长 x 宽 x 高) 或直径约50cm。
- 大鼠：典型尺寸为80cm x 80cm x 60cm (长 x 宽 x 高) 或直径约100cm。
- 区域划分：
- 中心区：通常定义为场地中央1/3或1/2面积区域。
- 周边区：紧贴场壁的周边区域（宽度通常定义为总边长1/4）。
- 角区：四个角落区域。
- (区域划分标准需在实验方案中明确定义比例或具体尺寸)。
- 视频采集系统：
- 高清摄像头固定于装置正上方，确保覆盖整个旷场范围。
- 提供稳定、均匀、无阴影的照明（典型照度范围：60 - 80 lux）。照明条件需保持一致。
- 摄像机连接电脑，用于实时记录和存储实验全程视频。
- 行为分析系统：
- 采用专业动物行为分析软件，基于视频流进行自动化行为识别与轨迹追踪。
- 软件需能准确识别动物轮廓质心，计算运动轨迹和空间位置。
- 计算机置于相邻房间，减少对动物的干扰。
- 环境控制：
- 在隔音、温湿度（通常22-24°C，湿度50-60%）恒定的独立行为学实验室进行。
- 背景噪音控制在较低水平（如<55 dB）。
- 气味控制：每次测试后彻底清洁旷场装置（推荐使用低残留消毒剂如70%乙醇，并充分晾干或通风去除气味），避免残留气味信息影响后续动物行为。
- 实验时段：通常在动物活动周期（夜行性啮齿类在暗期/傍晚）进行，并在固定时间段内完成实验以减少昼夜节律影响。
三、 实验动物准备
- 常用健康成年小鼠或大鼠。
- 适应期：实验前动物应在行为实验室饲养至少3-7天，适应环境光照和声音。
- 转运与静置：实验前将动物笼盒轻柔移至测试室，静置至少30-60分钟以适应环境。
- 实验顺序：动物测试顺序随机化处理。
四、 实验流程
- 软件设置：开启摄像机和行为分析软件，设定视频存储路径、实验时长（小鼠常用5-15分钟，大鼠常用10-30分钟，推荐10分钟）、待分析的检测指标参数（如区域划分标准）。
- 装置清洁：用规定清洁剂彻底清洁旷场内底板和壁面，去除气味和排泄物，充分晾干或通风。
- 动物放置：
- 轻柔抓取动物。
- 将动物面朝场壁轻柔放入旷场中心区域。
- 迅速离开测试室，关闭室门。
- 视频记录：软件立即开始同步记录动物在设定时间段内的全部行为活动。
- 实验结束：达到设定时间后，轻柔将动物取出放回原笼。
- 清洁与准备：重复步骤2，彻底清洁装置，准备下一只动物测试。
五、 核心检测项目（基于自动化视频分析） 行为分析软件自动提取以下关键指标，消除观察者主观偏差：
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运动活性 (Locomotor Activity):
- 总运动距离 (Total Distance Travelled)：动物在实验全程移动的总路径长度（单位：cm或m）。反映整体活动水平。
- 平均运动速度 (Average Velocity / Speed)：总距离除以实验时间（单位：cm/s）。反映运动活跃程度。
- 运动轨迹图 (Movement Trace / Path Plot)：可视化动物在旷场中的移动路径。
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空间偏好与探索行为 (Spatial Preference & Exploration):
- 中心区进入次数 (Number of Entries to Center)：动物身体（通常定义头部进入）穿越中心区边界的次数。反映探索倾向。
- 中心区停留时间 (Time Spent in Center Zone)：动物位于中心区域内的总时长（单位：秒）及其占比（%总时间）。核心焦虑指标：焦虑动物明显减少中心区活动。
- 周边区停留时间 (Time Spent in Periphery Zone)：动物位于周边区域内的总时长及占比。焦虑动物通常增加周边活动（趋触性）。
- 角区停留时间 (Time Spent in Corner Zones)：动物位于四个角落的总时长及占比。高度焦虑动物常在角落缩伏。
- 中心区运动距离 (Distance Travelled in Center)：在中心区移动的距离。区分是主动探索中心还是仅短暂穿越。
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焦虑相关行为 (Anxiety-like Behaviors):
- 定型环绕行为 (Thigmotaxis Index / Wall-seeking)：周边区停留时间 / 总时间 或 周边区运动距离 / 总距离。值越高，焦虑水平通常越高。
- 中心区回避指数 (Center Avoidance Index)：中心区停留时间占比的倒数或与其他区域的比值。
- 直立次数 (Rearing Frequency)：动物仅用后肢站立（可伴有前肢悬空或搭壁）的次数。既反映探索也受焦虑影响（在开阔区直立增多可能反映探索，在角落直立可能反映焦虑冲突）。
- 理毛次数/时间 (Grooming Frequency/Duration)：过度的自我理毛行为可能反映焦虑或刻板行为。需区分情境（如在角落长时间理毛更具焦虑意义）。
- 僵滞时间 (Freezing Time)：动物除呼吸外全身完全静止不动的时间（单位：秒）。反映恐惧或焦虑状态。
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探索与行为多样性:
- 区域转换次数 (Number of Zone Transitions)：动物在不同预定义区域（如中心、周边、角区）之间移动的次数。反映探索活跃度。
- 路径复杂度 (Path Complexity)：如弯曲度、路径熵等指标，反映运动模式的复杂性和探索策略。
- 首次进入中心区潜伏期 (Latency to First Entry to Center)：从实验开始到动物首次进入中心区的时间（单位：秒）。潜伏期越长，可能焦虑水平越高。
六、 数据分析与报告
- 原始数据提取：软件自动生成每个指标的原始数据文件。
- 数据标准化：根据实验时长进行分钟均一化处理（如运动距离/cm/5min）。
- 统计分析：根据实验设计（如组间比较：t检验/方差分析；时间序列：重复测量方差分析），运用合适的统计方法进行分析（显著性水平通常设p<0.05）。
- 结果呈现：
- 表格列出各组各项指标的平均值±标准误（Mean ± SEM）。
- 图形化展示：如柱状图（组间比较）、轨迹热图（空间偏好密度）、折线图（随时间变化）、散点图（指标间相关性）。
- 核心结果聚焦：重点报告反映焦虑（如中心时间%、定型环绕）、运动活性（总距离、平均速度）、探索（中心进入次数、潜伏期）的关键指标。
七、 实验伦理
- 实验方案必须经所在机构的实验动物管理和使用委员会批准。
- 遵循动物福利原则（3R：替代、减少、优化），最小化动物痛苦。
- 实验过程中密切观察动物行为，如有严重应激表现（如长时间僵滞、尖叫、过度挣扎），应按规定提前终止实验。
八、 软件分析模块的关键作用
- 精准追踪：自动识别动物轮廓质心，记录XY坐标，构建运动轨迹。
- 区域识别：根据设定的虚拟区域边界（中心、周边、角区），自动计算进出次数和时间。
- 行为识别：基于算法（如运动阈值、形态学）自动识别直立、理毛、僵滞等行为事件。
- 批量处理：高效处理大量动物视频数据，输出结构化结果。
- 可视化：生成运动轨迹图、活动热图、行为事件标注图等。
结论： 旷场实验结合自动化视频监控与分析，为量化评估啮齿类动物的自发活动、探索行为和焦虑样状态提供了客观、高效、可重复的方法。通过精心控制环境变量、严格执行实验流程、并利用软件精确计算核心检测指标（尤其是反映空间偏好和焦虑相关的指标），研究者能够可靠地检测药物、基因操作、疾病模型等因素对动物行为表型的影响。清晰定义实验标准和指标计算方法是保证结果可靠性和可重复性的关键。