干性黄斑变性模型(小鼠)

小鼠干性年龄相关性黄斑变性模型检测项目详解

干性年龄相关性黄斑变性（Dry AMD）是导致老年人不可逆视力丧失的主要原因，其特征性病变为视网膜色素上皮（RPE）细胞功能障碍、萎缩以及其下方的玻璃膜疣（Drusen）沉积。建立可靠的小鼠模型对于探究疾病机制和评估潜在疗法至关重要。以下是在这类模型中评估病理变化的核心检测项目体系：

一、 结构异常评估（组织病理学与影像学）

1. 眼底彩色照相与自发荧光成像 (Fundus Photography & Autofluorescence Imaging):

   • 目的： 宏观评估视网膜整体形态，检测玻璃膜疣样沉积物（呈现为亮点或斑块）的存在、数量、大小和分布，观察RPE萎缩区域（表现为低自发荧光区）。
   • 检测内容： 玻璃膜疣样沉积物的定性（有/无）和定量（数量、面积）； RPE萎缩区域的出现和范围。

2. 光学相干断层扫描 (Optical Coherence Tomography, OCT):

   • 目的： 非侵入性、高分辨率地活体观察视网膜各层结构。
   • 检测内容：
     • 视网膜/神经感觉层厚度： 测量特定区域（如中央视网膜）的整体厚度及外核层（ONL）厚度，评估光感受器细胞损失程度。
     • RPE层变化： 观察RPE层的完整性、厚度变化（萎缩变薄或异常增厚）和形态异常（如不规则、脱离迹象）。
     • 玻璃膜疣： 识别位于RPE下/Bruch膜上的高反射物质沉积，测量其高度和宽度。
     • 脉络膜厚度： 评估脉络膜是否变薄（常见于晚期AMD）。

3. 组织病理学检查 (Histopathology):

   • 目的： 提供细胞水平的金标准评估。
   • 样本处理： 眼球固定（通常用多聚甲醛）、石蜡或冰冻包埋、切片（矢状或冠状切面）。
   • 染色与检测内容：
     • 苏木精-伊红染色 (H&E): 基础评估视网膜各层结构完整性、细胞核排列、RPE形态、光感受器内外节结构、是否存在空泡化或细胞丢失，以及玻璃膜疣样沉积物的位置、大小和组成（嗜酸性）。
     • 周期酸-希夫染色 (PAS): 特异性显示基底沉积物（如Bruch膜增厚、玻璃膜疣样物质），因其富含糖蛋白而呈阳性。
     • 视网膜/RPE厚度测量： 在特定视网膜区域（如视神经旁、中周部）进行定量测量。
     • 光感受器细胞计数： 在特定区域（如视神经旁、中周部）定量计数外核层（ONL）细胞核数量。
     • 玻璃膜疣样沉积物定量： 计数特定视网膜区域的沉积物数量并测量其直径/面积。

4. 免疫组织化学/免疫荧光染色 (IHC/IF):

   • 目的： 定位和定量特定靶蛋白的表达与分布。
   • 常用靶点及检测内容：
     • RPE特异性标记物 (如RPE65, CRALBP): 评估RPE细胞的存在、形态、完整性及是否存在缺失/萎缩区域。
     • 光感受器细胞标记物 (如Rhodopsin - 视杆细胞, Opsin - 视锥细胞): 评估视杆/视锥细胞的存在、数量、外节结构完整性。
     • 补体系统成分 (如C3, C5b-9/MAC): 检测其在RPE下/玻璃膜疣样沉积物中的沉积，评估补体激活程度。
     • 炎症标记物 (如Iba1 - 小胶质细胞/巨噬细胞, GFAP - 胶质细胞活化): 评估视网膜内炎症反应的程度和位置（如小胶质细胞活化、迁移至外层视网膜，星形胶质细胞增生）。
     • 氧化应激标记物 (如4-HNE, 8-OHdG): 检测脂质过氧化和DNA氧化损伤的程度及定位。
     • 细胞凋亡标记物 (如Cleaved Caspase-3, TUNEL): 评估RPE细胞和光感受器细胞的凋亡水平。
     • 细胞外基质/基底膜成分 (如Collagen IV, Laminin): 观察Bruch膜的完整性及玻璃膜疣样沉积物的组成。
     • 脂质转运相关蛋白 (如ApoE): 评估其在沉积物形成中的作用。

二、 视网膜功能评估

5. 全视野视网膜电图 (Full-field Electroretinogram, ffERG):
   • 目的： 客观评估视网膜整体神经电生理功能，特别是光感受器细胞（视杆/视锥）和双极细胞的功能状态。
   • 检测内容：
     • 暗适应视杆反应 (Scotopic Rod Response)： 评估视杆细胞主导系统功能。
     • 暗适应最大混合反应 (Scotopic Mixed Rod-Cone Response)： 评估视杆系统和视杆通路双极细胞功能。
     • 明适应单次闪光视锥反应 (Photopic Single-flash Cone Response)： 评估视锥细胞主导系统功能。
     • 明适应闪烁光视锥反应 (Photopic Flicker Response)： 评估视锥通路内层视网膜功能。
   • 分析指标： a波振幅（反映光感受器功能）、b波振幅（主要反映双极细胞功能）、潜伏期。

三、 分子与生化标志物检测

6. 基因表达分析 (Gene Expression Analysis):

   • 目的： 检测与Dry AMD发病机制相关的关键基因在视网膜/RPE/脉络膜复合体中的表达变化。
   • 方法： 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)、RNA测序 (RNA-seq)。
   • 靶点示例： 补体通路基因（Cfb, Cfh, C3）、炎症因子（Il1b, Tnfa, Ccl2）、氧化应激相关基因（Ho1, Nqo1, Sod2）、胆固醇代谢基因（Abca1, Abcg1, Apoe）、RPE功能相关基因（Rpe65, Best1）等。

7. 蛋白质水平分析 (Protein Analysis):

   • 目的： 定量检测关键蛋白的表达水平或活性变化。
   • 方法： 蛋白质免疫印迹 (Western Blot)、酶联免疫吸附试验 (ELISA)、液相色谱-质谱联用 (LC-MS/MS) - 适用于视网膜/RPE/脉络膜组织匀浆液或血清。
   • 靶点示例： 补体因子（C3, CFB, CFH）、炎症因子（IL-1β, TNF-α, IL-6）、氧化应激标志物（MDA, 4-HNE加合物）、血管内皮生长因子（VEGF - 可能在Dry AMD慢性病理中存在变化）、RPE特异性蛋白（如RPE65）等。

四、 脂质代谢评估

8. 脂质组学分析 (Lipidomics):
   • 目的： 全面分析视网膜/RPE/脉络膜组织或玻璃膜疣样沉积物中的脂质组成变化。
   • 方法： 主要依赖质谱技术（如LC-MS/MS）。
   • 检测内容： 胆固醇及其酯化产物、磷脂（如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺）、鞘脂类（如神经酰胺）、氧化脂质等的种类和含量。特别关注脂质在细胞内外的异常累积。

总结：

构建完善的干性AMD小鼠模型评估体系需要多维度、多层次的检测项目组合。结构评估（眼底影像、OCT、组织学）是基础，直接反映核心病理特征（RPE萎缩、玻璃膜疣沉积、光感受器丢失）。功能评估（ERG）将结构变化与视力丧失关联起来。分子生化标志物检测（基因、蛋白、脂质）则深入揭示疾病发生发展的内在机制（补体激活、炎症、氧化应激、脂质代谢紊乱）。根据不同模型的特性（如基因敲除、药物诱导、老化模型）和研究目的（机制探索、药效评价），研究者需要灵活选择和优化上述检测项目组合，以全面、准确地表征模型的病理表型，为Dry AMD的研究提供坚实可靠的实验基础。所有检测方法的选择和应用应严格遵守实验室伦理规范和操作规程。